Structural and functional studies of Rootletin and Cep215, centrosomal proteins

Abstract

The centrosome is composed of two centrioles connected at right angles and the pericentriolar materials (PCM). The two centrioles are separated by disengagement in the G1 phase and connected to the linker fiber. Each centriole replicates the new daughter centriole and undergoes maturation of the centrosome. When the centrosome maturation progresses, nucleation of microtubules is generated at the PCM, and the mitotic spindle poles are formed. In Chapter 1, I explain the structural study of rootletin, a centrosome linker protein. This content is based on a paper (Ko, D., Kim, J., Rhee, K., and Choi, H.J., Identification of a Structurally Dynamic Domain for Oligomer Formation in Rootletin., Journal of Molecular Biology) published as a co-first author. Rootletin is a component of cilia's rootlet and is a coiled-coil protein that forms the linker fiber of two mother centrioles. According to the results of Prof. Kunsoo Rhee's laboratory, the coiled-coil domain 3 (CCD3) of Rootletin is essential for centrosomal localization and linking ability. A collaborative study for the structure and function of CCD3 was conducted. I analyzed the structural characteristics of CCD3 through the crystal structures of CCD3 1108-1200 and CCD3 1108-1317. In addition, the dynamic and oligomeric characteristics of the CCD3-6 fragment, which are essential for the function of rootletin, were investigated through biochemical analysis, such as crosslinking experiments and CD-analysis. Finally, the mutational study confirmed that the hydrophobic residues of CCD3 are important for the rootletin polymer formation, which is vital for the centriole linkage. In Chapter 2, I demonstrate the interaction of Cep215 and Pericentrin (PCNT), which assemble the substances around the PCM during centrosome maturation. Centrosomin motif (CM2) of Cep215 is localized to the centrosome by interacting with PCNT, and recruits other PCM proteins. Centrosomin (Cnn), Cep215 homologous protein in Drosophila, contains phospho-regulated multimerization domain (PReM) and CM2, and these two domains assemble themselves through interaction with each other. PReM is not preserved in human Cep215, and instead, PCNT plays a crucial role in PCM assembly. I determined the minimal binding fragment of PCNT required for CM2 interaction, and proposed an interaction model of the two proteins using the crystal structure of Cnn as a guide. This interaction model of CM2-PCNT was verified through SAXS (small angle X-ray scattering) and ITC (isothermal titration calorimetry) experiments. Together with the result of cellular experiment, it was confirmed that the hydrophobic residues of CM2, L1860 and L1867, are important for hetero-tetramer formation.

나는 중심체 단백질인 rootletin과 Cep215에 대한 구조적, 그리고 생화학적 연구를 수행하였다. 중심체는 직각으로 연결된 두 개의 중십립과 그 주변에 있는 중심체 주변 물질로 구성되어 있다. 두 중심립은 G1 기에 유리가 일어나고 연결 섬유로 이어진다. 그리고 각각의 중심립은 새로운 딸 중심립을 복제하며 중심체 주변 물질의 성숙 과정을 거친다. 중심체 성숙이 진행되면 미세소관의 결정핵이 중심체 주변 물질에 생성되며 방추사가 형성된다. 1장에서는 중심체 연결 단백질인 rootletin에 대한 구조 연구에 대해 설명하겠다. 이 내용은 본인이 공동 1저자로 참여하여 2020년 출판된 논문 (Ko, D., Kim, J., Rhee, K., and Choi, H.J. Identification of a Structurally Dynamic Domain for Oligomer Formation in Rootletin. Journal of Molecular Biology) 을 기반으로 한다. Rootletin은 섬모의 뿌리구조의 구성요소이며 두 모중심립의 연결 섬유를 이루고 있는 또꼬인나선형 (coiled-coil) 단백질이다. Rootletin의 또꼬인나선 3번째 조각 (CCD3)이 중심체로 위치하는 것과 중심립 연결 능력에 중요하다는 이건수 교수님 실험실의 선행 연구 결과에 기반하여 CCD3에 대한 구조와 기능연구를 공동으로 진행하였다. 나는 CCD3 1108-1200와 CCD3 1108-1317의 X-선 결정 구조 규명을 통해 CCD3의 구조적 특징에 대해 분석하였다. 또한, rootletin의 기능에 중요한 CCD3-6 조각에 대해 교차결합 실험과 원이색성 분광광도계를 이용한 생화학 분석을 통하여 중합체를 형성하는 역동적인 특성을 밝혀냈다. 그리고, 중합체 형성에 중요한 CCD3의 소수성 아미노산 잔기들을 돌연변이 시킴으로써 중합체 형성이 억제되는 것을 확인하였고, 세포 내에서 이러한 돌연변이체는 연결 섬유의 역할을 제대로 수행하지 못함을 관찰하였다. 2장에서는 중심체 성숙과정에서 중심체 주변 물질들의 조립에 관여하는 Cep215와 Pericentrin (PCNT)의 상호작용에 대해 설명하였다. Cep215의 Centrosomin motif (CM2)는 PCNT와의 상호작용을 통하여 중심체 주변 물질에 도달하며 다른 단백질들을 모집한다. Drosophila의 centrosomin (Cnn)이라는 Cep215 상동 단백질은 PReM과 CM2를 가지고 있으며 이 두 부위가 서로 상호작용을 통해 스스로 조립된다. 사람의 Cep215에는 PReM이 보존 되어있지 않고 PCNT가 중심체 주변물질의 조립에 핵심적인 역할을 한다. 나는 CM2와 PCNT의 상호작용에 있어서 Cep215의 최소 조각 helix를 알아냈고, 이미 알려진 Cnn의 X-선 결정 구조를 기반으로 Cep215와 PCNT 두 단백질의 상호작용 모델을 제시하였다. 소각 X-선 산란 실험과 등온 적정형 열량계를 이용한 실험을 통해 이러한 두 단백질상호작용 모델을 검증하였고, 이형 4분자체 형성에서 Cep215의 소수성 잔기, L1860과 L1867이 중요하게 작용함을 확인하였다.