Studies on supernumerary centrioles in TP53, PCNT and CEP215 triple knockout cells

Abstract

The centrosome is a subcellular organelle that functions as a major microtubule organizing center in most animal cells. It is composed of centrioles and surrounding pericentriolar material (PCM). During mitosis, centrosomes function as spindle poles to pull a set of chromosomes into daughter cells, and abnormality in centrosome numbers leads to spindle pole disorder. Therefore, the centriole number has to be tightly regulated during the cell cycle for successful cell division. In fact, centrosome amplification is often observed in many cancer cells. In my dissertation, I generated HeLa cell lines in which the TP53, PCNT and CEP215 genes are deleted and observed the phenotypes related to centriole behavior during the cell cycle. In chapter I, I observed centriolar phenotypes in the CEP215 deleted cells. CEP215 is a major PCM protein that recruits the γ-tubulin ring complex for microtubule organization. In my dissertation research, I observed that daughter centrioles were prematurely separated from the mother centrioles in CEP215 knockout cells. I also generated TP53, PCNT and CEP215 triple knockout cells and observed centriole amplification as well as precocious centriole separation. Based on the observations, I propose that CEP215 is involved in maintaining the mother and daughter centriole association during mitosis. In chapter II, I studied centriolar phenotypes in the TP53, PCNT and CEP215 triple knockout cells. I observed the unscheduled amplification of centrioles in the triple knockout cells during mitosis. The amplified centrioles lack the ability to function as the template for centriole assembly during the subsequent S phase. They also lack the ability to organize microtubules. Nonetheless, I do not rule out the possibility that the amplified centrioles may occasionally disturb bipolar spindle pole formation during mitosis. My works propose a novel mechanism by which supernumerary centrioles are generated in the cells depleted of PCM in the mitotic centrosomes.

중심체는 동물 세포에서 미세 소관을 형성하는 주요 기관으로, 중심립과 중심구로 이루어져있다. 중심구는 미세 소관의 말단에 집적하여 세포내 미세소관 망을 구축하는 역할을 하고, 중심립은 이러한 중심구를 모으는 중추의 역할을 한다. 중심체의 복제는 세포 주기와 밀접하게 연관되어있다. DNA 복제 주기와 비슷하게 S기 동안에는 중심립의 개수가 2개에서 4개로 늘어나고 M기에는 두개의 중심체가 세포의 양끝으로 이동해 양극성 방추사를 형성한다. 중심체는 간기 동안에는 세포의 모양, 세포 내 운 수송을 용이하게 하고 중기 동안에는 세포 분열에 중추적인 역할을 한다. 미세 소관을 만드는 역할은 중심구에서 이루어지지만 이러한 중심구를 모으는게 중심립이기 때문에 중심립 개수의 이상은 세포의 중기에 특히 문제를 야기하고 이는 염색체 수 이상, invapodopia를 유발하여 암과 밀접하게 연관되어 있다고 알려져 있다. 중심체의 주요 단백질인 CEP215와 PCNT가 동시에 결실된 상황에서 이의 표현형을 관찰함으로써 이들 단백질들의 기능을 총체적으로 이해하고자 하였다. 제 1장에서는 중심체 주요 단백질인 CEP215의 세포분열기에 중심립 결합과 새로운 중심립 복제에 있어서의 중요성에 대하여 연구하고자 하였다. CEP215는 기존 knockdown실험으로 밝혀진 바에 의하면 γ-tubulin의 중심체로의 밀집에 중요한 역할을 한다고 밝혀져 있고, 중기에 중심체의 결합에 중요하다고 알려져 있다. CEP215의 유전자가 아예 발현하지 않는 세포 주를 제작해 이른 중기를 관찰한 결과, 중심립의 이격 현상을 관찰할 수 있었다. CEP215의 다양한 발현 억제 표현형을 관찰한 결과 이 이격 현상에는 CEP215와 PCNT의 결합이 중요하다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 CEP215와 PCNT의 동시 결핍 세포 주를 제작, 관찰한 결과에서는 CEP215가 새로운 중심립을 형성시킬 수 있게 하는 것에 있어 중요함을 알 수 있었다. 제 2장에서는 CEP215와 PCNT의 동시 결핍 세포 주에서 보이는 과 복제 중심립들이 언제 만들어지는지, 이 중심립들이 어떻게 되는지 연구하고자 하였다. PLK4를 과 발현 시켜 만들어지는 과 복제 중심립들과 세포 주기 동안 비교 분석하였다. 중심체 단백질들이 없어지면서 만들어지는 이 과 복제 된 중심립들은 M기에 형성되는 것으로 보였으며, PLK4가 과 발현되면서 만들어지는 중심립들은 S기 동안 증폭되는 것을 관찰 할 수 있었다. 또한 knockout 세포 주의 과 복제 중심립들은 PLK4 과 발현을 통해 만들어진 과 복제 중심립들과 다르게 새로운 중심립을 만들지 못하며 미세소관도 만들지 못하는 것을 관찰 할 수 있었다. 따라서 이 연구를 통해 중심구의 파괴도 중심립의 과 복제 현상을 야기시킬수 있으며, 이로 인해 M기에 만들어진 중심립들은 세포주기동안 중심체로서 역할을 하지 못하는 것을 발견할 수 있었다.