후성유전 인자 PHF6와 PHF7의 기능 및 구조 연구

Abstract

PHD finger protein (PHF)은 다양한 기능 및 구조를 가지며 Plant Homeodomain (PHD) 도메인을 통해 다양한 히스톤 변형과 상호작용하여 후성유전 인자로서 기능하는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 후성유전 인자 PHD finger protein 6 (PHF6)와 PHD finger protein 7 (PHF7)의 생화학적 분석을 통해 작용 메커니즘을 밝혀내고자 하였다. PHF7은 정자 발생 과정에서 히스톤의 유비퀴틴화를 통해 정상적인 크로마틴 압축이 일어나도록 조절하는 후성유전 인자로 알려져 있지만, 그 메커니즘에 대한 이해는 부족하다. 본 연구에서는 PHF7을 구성하는 각 도메인과 E2 유비퀴틴 접합 효소(E2)와의 상호작용을 등온 적정 열량 측정(ITC) 기법을 통해 확인하였고, in vitro 유비퀴틴화 assay를 통해 히스톤 H3에 대한 유비퀴틴화 활성을 비교하는 등 다방면의 생화학적 분석을 진행하였다. 이를 통해 PHF7과 E2의 결합 및 유비퀴틴화 활성을 위해 RING 도메인과 PHD 도메인이 모두 필요하다는 사실을 실험적으로 증명하였고, 특히 두 도메인 사이에 존재하는 linker가 E2와의 상호작용에 관여할 것을 제안한다. 이를 토대로 추후 구조적 연구를 수행하여 PHF7의 분자적 메커니즘을 구체화할 수 있을 것으로 기대된다. 또 다른 후성유전 인자 PHF6는 발생 단계에 중요한 인자로서 일부 구조가 규명되었지만, 정확한 히스톤 인지 메커니즘은 확인된 바 없었다. 본 연구에서는 태반 발생 과정을 조절하는 PHF6가 H2BK12 아세틸화(H2BK12Ac)를 특이적으로 인지할 수 있다는 사실을 밝혀냈다. PHF6와 H2BK12Ac의 결합 친화성을 미세규모 열 영동(MST) 기법을 이용해 정량적으로 측정했으며, PHF6의 구조에 기반하여 해당 상호작용에 ePHD2 도메인의 E-rich 모티프가 중요하게 작용하는 것을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 후속 연구를 통해 PHF6가 H2BK120에 대한 E3 유비퀴틴 연결 효소로 작용하는 데에 H2BK12Ac 인지가 선행되어야 한다는 근거로 이어질 수 있었으며, 배아줄기세포가 영양외배엽으로 분화하는 과정에서 PHF6의 역할을 정량적으로 분석했다는 데에 의의가 있다.

PHD finger proteins (PHF) are known to function as epigenetic regulators by interacting with histone modifications through the Plant Homeodomain (PHD). In this study, I tried to elucidate the molecular mechanisms of PHD finger protein 6 (PHF6) and PHD finger protein 7 (PHF7) by biochemical analyses. PHF7 is known as an epigenetic regulator that controls normal chromatin compression through the ubiquitination of histones in the process of sperm development, but there is a lack of understanding of its precise mechanism. Here, I identified which domains of PHF7 are important for interaction with the E2 ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and for histone H3 ubiquitination by using isothermal titration calorimetry (ITC) analysis and in vitro ubiquitination assay, respectively. These results demonstrate that both RING and PHD domains are necessary for interaction with E2 and ubiquitination activity of PHF7. I also suggest that the linker, connecting RING and PHD, engages in the interaction with E2. Further structural research based on this study will be required to understand the molecular mechanism of PHF7 in detail. Another epigenetic regulator PHF6 was identified as an important factor in the developmental stage, but the exact mechanism of histone recognition has not been investigated. This study shows that PHF6 could specifically recognize acetylation of H2BK12 (H2BK12Ac). Based on the structure of PHF6, I reasonably assumed that the E-rich motif of the ePHD2 domain plays an important role in the interaction with H2BK12Ac, and in fact, this hypothesis was confirmed by measuring the binding affinity of PHF6 and H2BK12Ac using microscale thermophoresis (MST) analysis. This study explains the role of PHF6 in the differentiation of embryonic stem cells into a trophectodermal lineage.