Fumarate modulates phospholipase A2 receptor autoimmunity-induced podocyte injury in membranous nephropathy

Abstract

Downstream mechanisms that lead to podocyte injury mediated by phospholipase A2 receptor (PLA2R) autoimmunity remain elusive. Accumulating evidence has been shown that increased production of reactive oxygen species (ROS) can cause podocyte injury. Also, the activation of the complement system which involved the ROS generation has been identified in membranous nephropathy (MN). Among the molecules related to ROS, fumarate was recently known to be involved in the podocyte injury. Here, the role of fumarate in modulating phospholipase A2 receptor-mediated podocyte injury was investigated in in vitro model of PLA2R-associated MN. Fumarate hydratase, which hydrolyzes fumarate, colocalized with podocalyxin, and its expression was lower in glomerular sections from patients with PLA2R-associated MN than in those from healthy individuals, patients with non-PLA2R associated MN or minimal change disease. To elucidate the role of fumarate in podocyte injury in in vitro model of PLA2R-associated MN, the immunoglobulin G (IgG) was purified from the serum of patients with PLA2R-associated MN (MN-IgG) and a healthy control (Con-IgG). The purified MN-IgG reacted with the 153 kDa band when the lysates of primary cultured human podocytes were immunoblotted, but Con-IgG did not. Podocytes stimulated with MN-IgG decreased expression of fumarate hydratase and increased fumarate levels. These changes were coupled to alterations in the expression of molecules involved in the phenotypic profile of podocytes (WT1, ZO-1, Snail, and Fibronectin), an increase in albumin flux across the podocyte layer and the production of ROS in podocytes. However, overexpression of fumarate hydratase ameliorated these alterations. Furthermore, knockdown of fumarate hydratase exhibited synergistic effects with MN-IgG treatment. Thus, fumarate may promote changes in the phenotypic profiles of podocytes after the development of PLA2R autoimmunity. These findings suggest that fumarate could serve as a potential target for the treatment of PLA2R-associated MN.

막성신증에서 phospholipase A2 (PLA2) 수용체 자가면역에 따른 족세포 손상의 기전에 대해서는 밝혀져 있지 않다. 족세포 손상을 일으키는 기전 중 활성산소종이 작용할 것이라는 기존의 연구가 있으며 막성신증에서 활성산소종을 생성하는 보체계 활성화가 알려져 있다. 활성산소종과 관련된 물질 중 푸마르산은 최근 연구에서 족세포 손상에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 본 연구에서는 PLA2 수용체 관련 막성신증 세포 모델에서 PLA2R 수용체 자가면역 유도에 따른 족세포 손상의 기전에 푸마르산이 관여한다는 가설을 세웠다. 푸마르산을 대사하는 효소인 푸마라아제 활성이 정상 신장조직의 사구체에서는 포도칼릭신과 병합되어 잘 나타났지만, PLA2 수용체 관련 막성신증 환자의 신장조직의 사구체에서는 정상 신장조직, PLA2 수용체 비관련 막성신증 환자, 미세변화신증 환자의 신장조직에서의 사구체 푸마라아제 활성과 비교하여 감소하는 것을 확인하였다. 생체 외 실험을 위해 막성신증 환자 중에서 혈청 항 PLA2 수용체 항체 역가가 양성인 환자와 정상인에게서 혈청을 얻어 각각의 혈청으로부터 면역 글로불린 G 를 정제하였다. 세포 실험을 위해서 신장절제술을 받은 환자에게서 얻은 신장조직에서 일차 배양한 사람의 족세포를 사용하였다. 각각의 면역 글로불린 G 와, 사람 족세포에서 추출한 단백질을 이용하여 웨스턴 블랏을 시행하였고 항 PLA2 수용체 항체 역가가 양성인 환자의 혈청에서 정제한 면역 글로불린 G 로 자극한 족세포에서만 항 PLA2 수용체 밴드를 153 kDa 위치에서 확인하였다. 항 PLA2 수용체 항체 역가가 양성인 환자의 혈청에서 정제한 면역 글로불린 G 로 자극한 족세포에서는 푸마라아제 활성이 감소한 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였고 정상인 혈청에서 정제한 면역 글로불린 G 로 자극한 족세포와 비교하여 푸마르산 농도가 증가하였다. 이러한 변화는 족세포 형질전환에 관여하는 물질인 WT1, ZO-1 의 감소, Snail, 그리고 Fibronectin의 증가, 그리고 족세포 층을 가로지르는 알부민 유량의 증가, 활성산소종의 증가와 동반하였다. 이러한 족세포내의 WT1, ZO-1 의 단백질 발현의 감소는 푸마라아제 lentiviral particles를 처리하여 족세포의 푸마라아제 활성을 증가시켰을 때에는 회복되었으며 증가되었던 Snail 과 Fibronectin 단백질 발현과 활성산소종의 생성은 감소하였다. Small interfering RNA 를 사용하여 족세포에서 푸마라아제 활성을 감소시켰을 때에는 항 PLA2 수용체 항체 역가가 양성인 환자의 혈청에서 정제한 면역 글로불린 G 로 자극한 족세포에서 감소한 푸마라아제 활성이 더욱 감소하였고 더불어 WT1, ZO-1 의 약화된 발현이 더욱 약화되고, 증가한 fibronectin 과 Snail 의 단백질 발현 활성산소종의 생성이 더욱 증가하는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 PLA2 수용체 매개 자가면역에 따라 족세포에서 감소되는 푸마라아제의 활성, 증가된 푸마르산의 결과로 족세포 표현형 변화가 유도되어 족세포 손상에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 푸마르산이 PLA2 수용체 관련 막성신증 치료의 표적이 될 수 있는 것을 시사한다.