Proteomic identification of early urinary-biomarkers of acute kidney injury in preterm infants

Abstract

Background: The immature preterm kidney is likely to be vulnerable to acute kidney injury (AKI). However, the biomarkers currently used for AKI are not sensitive or specific and are also inadequate for the timely detection of AKI in preterm infants. Objective: The objectives of this study were to identify novel urinary biomarkers of AKI using proteomic techniques, and to verify and validate that the candidates can serve as early predictive biomarkers for AKI. Materials: The biomarker development process was divided the following 3 phases: Five paired urine samples were analyzed in the discovery phase. For verification, a prospective nested case-control study compared serial urinary proteomes of 16 patients with AKI and 16 patients without AKI. For validation, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) were performed using samples of the first-day urine from 14 preterm infants with AKI and from 14 matched control patients. Results: In total, 1,810 proteins were identified in the discovery phase. Among those proteins, 174 were selected as the 1st targeted proteins. A total of 168 proteins were quantified, and the levels of 6 were significantly increased in the AKI group in the verification phase. Using a clinical assay, the results were confirmed and validated using samples of the first-day urine after birth from the biorepository. Finally, ELISAs revealed that the levels of annexin A5, neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), and protein S100-P were significantly higher in the samples of the first-day urine from patients with AKI than in those from patients without AKI. Conclusion: Urinary annexin A5, NGAL and protein S100-P levels are promising biomarkers for early, accurate prediction of AKI in preterm infants.

목적 최근 의료기술의 현저한 발전으로 인해 극소저출생체중아의 생존률은 현저히 높아지면서, 미숙아의 생존률과 함께 장기적 예후에 대한 관심이 높아지고 있다. 특히 태아의 발달 과정중에 태어난 미숙아는 여러 발달 단계의 손상 및 정체를 겪게 되며, 이는 장기적으로 성인기의 여러 만성 질환 발생 및 대사 증후군의 위험도를 증가시킨다는 연구들이 발표되고 있다. 미숙아에서 급성 신손상의 발생률은 약 8-24%로의 비율로 발생한다고 보고하고 있으며, 특히 출생 체중이 1500 g 미만의 극소 저출생체중아에서의 급성 신손상의 발생률은 20-30%로 높은 비율을 차지한다고 알려져 있다. 이러한 신장의 손상은 미숙아의 단기 사망률 및 여러 질환의 이환율 증가에 영향을 주며, 생존한 미숙아의 장기적 예후에도 나쁜 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서, 미숙아에서 신장 기능의 손상을 조기에 발견하고 모니터링 하는 것은 이후 반복되는 신장 손상을 예방하고 추적관찰 함으로써 장기적 예후를 호전시키는데 도움이 될 수 있을 것이다. 이에 본 연구는 Proteomics를 이용하여 미숙아의 급성 신손상을 예측할 수 있는 urinary biomarker를 찾아, 미숙아의 급성 신손상을 조기에 발견하고자 하며 이에 대한 임상적인 유용성을 확인하고자 한다.

방법 본 연구는 총 3단계로 진행한다. 1. Discovery phase: 재태 주수 32주 미만 혹은 출생 체중 1500g 미만의 미숙아로 동맥관 개존증으로 ibuprofen약물 사용이 결정되는 경우, 약물 투여 전과 후의 약 6시간씩 소변을 전향적으로 수집한다. ibuprofen 투여 후 신손상이 확인된 환자들의 소변을 대상으로 ibuprofen 투여 전과 후 소변을 label-free mass spectrometry (MS) based protein quantification을 이용하여 분석하여 이중 의미 있게 변화하는 단백질을 candidate biomarker로 선정한다. 2. Verification phase: 재태 주수 32주 미만 혹은 출생 체중 1500g 미만의 미숙아를 대상으로 서울대학교병원 신생아중환자실에서 진행하는 신생아중환자실에 입원한 신생아의 임상적 database수집과 생물학적 검체 은행 구축 연구에 동의하여 보관되어진 소변 검체를 이용하며, 급성 신손상이 발생한 미숙아의 소변과, 주수와 출생 후 나이를 matching한 대조군 소변을 골라 discovery phase에서 확인된 candidate biomarker를 target으로 data-independent acquisition (DIA) method를 통해 분석한다. 3. Validation phase: 서울대학교병원 신생아중환자실에서 진행하는 검체 은행 구축 연구에 동의하여 보관된 소변 검체 를 이용하여, 출생 7일 이내 급성 신손상이 발생한 환자의 첫 소변 검체와, 주수를 matching한 대조군의 출생 첫 소변 검체를 이용하여 biomarker가 출생 첫 날부터 의미 있게 증가하여 임상적 유용성이 있는지를 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하여 분석한다.

결과 총 1,810개의 단백질이 discovery phase에서 발견되었으며, 그 중 349개의 단백질이 2배 혹은 그 이상의 변화를 보였다. 이 중, discovery phase의 대상자인 5명의 환자 중 4명에서 2배 이상의 증가 혹은 감소의 변화를 보인 107의 단백질과, 5명 모두에서 2배 이상의 변화를 보인 67개의 단백질을 1st targeted candidate로 선정하였다. 이를 이용하여 총 16 명의 급성 신손상을 보인 환자의 소변 검체와, 주수와 출생 후 나이를 매칭한 대조군 16명의 소변 검체를 이용하여 verification 을 진행하였다. 총 174개의 1st targeted candidates 단백질 중에서 168개만이 분석되었고, 이중 총 6개의 단백질인 Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), cartilage intermediate layer protein 2 (CLIP-2), 6-phosphogluconolactonase (6-PGLS), annexin A5, galectin 3, protein S100-P가 통계적으로 의미 있게 차이가 있음을 확인되어 최종 후보 단백질로 선정되었다. 이를 대상으로 총 14쌍의 환자와 대조군의 생후 첫 소변 검체에서 의미 있는 차이를 보이는지 ELISA를 이용하여 validation을 시행하였으며, 6개의 후보 단백질 중 NGAL, annexin A5, 6-PGLS, protein S100-P가 환자군에서 의미 있게 증가함을 확인하였다. 급성 신손상을 예측하는 능력을 보기 위해 the area under the curve (AUCs)를 확인하였으며, 최종 NGAL, annexin A5, protein S100-P의 조합이 AUC 0.932의 높은 예측력을 보였다. 결론 NGAL, protein S100-P, annexin A5가 출생 직후 급성 신손상의 위험을 예측하는 biomarker로 확인되었다. 본 연구를 통해 proteomic을 이용한 급성 신손상을 예측하기 위한 새로운 urinary biomarker를 발견하였으며, 이를 통해 미숙아의 신손상을 조기에 예측하고 출생 후 추가적인 신손상을 예방하여 예후를 향상시키는데 도움을 줄 수 있을 것이다