Renal protective effects of αklotho in diabetic nephropathy model

Abstract

αklotho is an anti-ageing protein mainly expressed in the kidney. αklotho exists as two different forms, membrane and soluble αklotho, and soluble αklotho enters into the circulation. αklotho mainly functions as co-receptor of fibroblast growth factor 23 (FGF23) and causes phosphaturia. However, αklotho has various effects including autophagy, wound healing, insulin sensitivity, and calcium homeostasis and to have anti-fibrosis, antioxidant, and anti-senescence activity, suggesting that αklotho functions beyond FGF23 signaling. In fact, studies reported that inducing klotho expression or treating αklotho protein are resulted as renal protective effects. Since αklotho declines during renal dysfunction, including diabetic nephropathy (DN), we hypothesized that αklotho may perform renal protective effects against DN. To find out, recombinant αklotho protein was injected to db/db mice, which is type 2 diabetes mouse model. As result, αklotho protected podocytes by suppressing DN-induced TRPC6 overexpression. Moreover, αklotho is discovered to have mitochondrial protective roles in proximal tubule, by activating AMPK-PGC1α signaling. In addition, in distal tubule, αklotho enhanced TRPV5 calcium transporter, therefore ameliorates hypocalcinuria, which is an early symptom of DN. Taken together, αklotho shows renal protective effects against DN in various renal cells.

배경 당뇨병은 혈당의 급격한 증가로 인해 발생하며, 만성 콩팥병과 노화에도 큰 연관성을 가진다. 실제로 제 2형 당뇨병환자의 약 50%, 제 1형 당뇨병환자의 약 3분의 1이 신기능 저하와 단백뇨 현상을 보인다. 따라서, 미국에서는 당뇨병성 신증이 만성 신부전증의 주요 원인으로 자리매김하고 있다. αklotho는 주로 신장에서 발현하는 항노화 물질이며, 당뇨병성 신증에 의해 그 발현량이 감소한다. αklotho는 신장내 세뇨관뿐 아니라 족세포에서도 그 발현이 관찰된다. αklotho의 가장 잘 알려진 기능으로는 섬유아세포 성장인자 23의 수용체로서, 인산뇨 배출을 유도하는 것이다. 하지만 가용성 형태의 αklotho 가 혈류를 타고 흐른다는 점과, 다양한 다른 분자와 결합할 수 있다는 특징으로 인해 여러 기능이 있을 것으로 생각되어진다. 실제로 αklotho는 자식 작용 (autophagy), 상처회복, 항산화 작용, 인슐린 민감도증가 등에도 관련이 있다는 보고가 있다. 본 연구는 αklotho가 기존에 알려진 기능 외에 다른 기전으로 당뇨병성 신증 모델의 마우스에서 신기능 보호 효과가 있는지 연구하기위해 제 2형 당뇨병 모델인 db/db 마우스에 재조합 αklotho 단백질을 8주간 주사하였다. 그 결과 αklotho는 신장 족세포 (podocyte)에서 TRPC6의 과발현을 방지하여 족세포 밑 사구체 손상을 방지하여 단백뇨를 예방하였다. 뿐만 아니라 근위 세뇨관에서 αklotho는 AMPK-PGC1α을 증가시켜 db/db 마우스의 신장내 미토콘드리아가 보호되는 효과를 관찰하였다. 추가로 원위 세뇨관에서 αklotho가 TRPV5와 세포막 단백질인 galectin-1 과 동시결합함으로 인해 초기 당뇨병에서 발생하는 TRPV5 감소현상을 방지하고 칼슘뇨배출증가를 방지하는 기전을 새롭게 발견하였다. 이 연구들을 통해 항노화물질인 αklotho가 당뇨병성 신증모델에서 다양한 신기능 보호효과를 가진 물질임을 주장하고자 한다.

방법 제 2형 당뇨병의 마우스 모델인 db/db 마우스 (수컷, 6주령) 을 14두 구입하여, 그중 7두에 재조합 αklotho 단백질 (rKL) 을 8주간, 10μg/kg로 매일 복강주사하여, vehicle (saline) 을 주사한 남은 7두의 db/db 마우스와 비교하였다. 또한 대조군으로 db/m 마우스 (수컷, 6주령)을 14두 구입하여, 그중 7두에 rKL을 주사했고, 남은 7두는 saline을 주사하였다. 추가로 당뇨와 다른 단백뇨 모델을 만들기 위해 PAN을 주사할 마우스 7두 (수컷, 7주령) 구입하여 2주에 1회, 100mg/kg 로 복강주사 하였다. 모든 마우스는 주사기간 종료직후 metabolic cage를 이용하여 24시간 소변을 채취하였고, 이후 희생되었다. 희생직전 모든 마우스의 혈압, 혈당, 체중을 측정하였고, 희생직후 신장을 채취하였다. In vitro 연구로는 마우스 S1 근위세뇨관 세포과 원위세뇨관 세포, 그리고 마우스의 족세포 (podocyte)를 이용하였다. 당뇨를 모방하기위해 30m의 고농축 포도당 과 5mM의 정상 포도당 처리군에서 rKL 처리/비처리군으로 나누어 24시간 처리 후 각 분자의 발현량을 분석하였다.

결과 rKL을 처리한 db/db 마우스에서는 saline만을 처리한 대조군 db/db그룹에 비해 1) TRPC6의 현저한 감소, 사구체 손상의 감소, 칼슘 뇨배출의 감소를 보였고, 2) 신장내 미코콘드리아 손상의 감소, AMPK-PGC1α 의 증가, 신장 내 NAD+ 의 증가를 보였으며, 3) 신장의 TRPV5 의 증가와 칼슘뇨배출의 현저한 감소를 보였다. 배양한 세포를 이용한 in vitro 연구에서는 rKL 을 처리한 고 포도당 군에서 대조군 고 포도당 군에 비해4) 배양한 족세포에서 TRPC6와 세포내 칼슘농도의 감소, 그리고 synaptopodin의 증가와 족세포 생존률이 증가함을 확인하였고, 5) 근위세뇨관 세포에서의 미토콘드리아 회복 및 기능 증가, AMPK-PGC1α 의 증가를 확인 하였으며, 6) 원위세뇨관 세포에서의 TRPV5 증가와 αklotho, TRPV5, galectin-1 의 결합, 그리고 OTX008로 galectin-1을 억제하자 αklotho가 TRPV5를 증가시키지 못함을 확인하였다.

결론 재조합 αklotho(rKL)는 db/db 마우스에서 TRPC6과발현 억제를 통해 사구체를 보호함으로써 단백뇨를 감소시켰고, LKB1 활성화를 통한 AMPK-PGC1α을 증가시켜 근위세뇨관에서 미토콘드리아를 보호하였으며, 원위세뇨관에서는 TRPV5와 galectin-1 과 동시결합하여 TRPV5를 membrane에 붙잡아 둠으로써 당뇨에서 발생하는 TRPV5의 감소를 저해하여 칼슘뇨배출을 억제하였다. 본 연구의 결과는 αklotho가 항 노화물질 뿐 아니라 항 당뇨성 물질로도 큰 도움이 될 수 있음을 시사한다.