The eGRASP expression on neurons, astrocytes, and HEK293T cells in vitro

Abstract

Studies on astrocytes have been focused on unveiling its interplay with neurons to understand the physiological properties of nerve systems, leading to both fundamental interests and clinical applications including the origins of neurodegenerative diseases. In terms of synaptic transmission, major role of astrocytes is forming tripartite synapse among postsynaptic neurons and presynaptic neurons. However, progress in the understanding of interactions among tripartite synapses has been limited to topical observation for lack of effective technologies to visualize synapses. Recently, the dual-eGRASP was developed to label synapses of targeted neurons in the mammalian brain. The technique made it possible to compare the activity- or region-dependent strength of synapses, potentially providing a tool to elucidate the role of neuronal connectivity in learning and memory. Here, I verified the eGRASP signals to be present in in vitro rodent primary neurons and astrocytes, expanding the applications of previously published dual-eGRASP methodology. The eGRASP signals were expressed among various cells including neurons, astrocytes, and HEK293T cells, regardless of transfection methods. Especially, the signals appeared in the form of faces at contacts between cells: dendritic shafts and adjoining astrocytes or HEK293T cells. The results substantiate that the in vitro eGRASP provides a promising method to elucidate not only physiologies of nerve systems in controlled environment, but also of any cellular systems with an arbitrary level of external control.

성상세포와 뉴런 사이의 상호 작용 연구는 신경계의 생리적 특성을 이해하고 신경 퇴행성 질환을 비롯한 임상적 측면에 적용하기 위해 진행되어 왔다. 시냅스 신호 전달의 측면에서 성상세포의 주요 기능은 시냅스 후 뉴런과 시냅스 전 뉴런 사이에서 '삼자 간 시냅스'를 형성하는 것이다. 그러나 시냅스를 효율적으로 시각화하는 기술이 부족하였기에 삼자 간 시냅스에 대한 이해는 국소적인 관찰에 그쳤다. 최근 dual-eGRASP 기술이 개발되어 포유류 뇌에 있는 표적 뉴런의 시냅스 표시가 가능해졌다. 이 기법은 시냅스의 활성 상태나 지역에 따른 강도의 비교를 가능하게 했으며, 학습과 기억에서 뉴런 간 연결이 어떤 기능을 하는지 설명할 도구를 제공했다. 본 학위논문은 dual eGRASP 방법론의 적용을 확대하여 시험관 내에서 일차 뉴런과 성상세포 eGRASP 신호를 검증했다. eGRASP는 형질 전환 방법에 상관없이 뉴런, 성상세포, HEK293T 세포 등 다양한 세포 사이에서 발현됐다. 신호는 수상돌기의 축과 인접한 성상세포ᆞHEK293T 세포 사이의 접촉 사이에서 면의 형태로 나타났다. 이러한 결과는 시험관 내 eGRASP가 통제된 환경의 신경계의 생리학 연구와 더불어 다양한 세포의 생리학을 설명할 유망한 방법을 제공한다는 것을 입증한다.