Chronological Progression of Rat Apical Periodontitis: Analysis of Micro-CT, Histopathology, and Bacterial Microbiota

Abstract

The purpose of this study is to analyze the chronological change of apical periodontitis in the rat model using radiographic, histopathological and bacterial microbiota analysis. Six-week-old Sprague-Dawley rats were divided into a control group (n=2) without pulp exposure and three experimental groups (n=6) (G1W; 1 week after pulp exposure, G2W; 2 weeks after pulp exposure, G3W; 3 weeks after pulp exposure). The pulp of the mandibular first molar was exposed with a #1/4 round bur under zoletil anesthesia in the experimental group, and exposed to the oral cavity for 1, 2, 3 weeks. Under zoletil anesthesia, in-vivo micro CT was taken every week with G3W group, to obtain Region of Interest at a consistent location using a mutual information-based 3-D registration technique, and to measure the volume change of apical lesions through the k-means clustering method. For histopathological analysis, jaw bones were collected and demineralized, and then H&E staining was performed to observe the teeth with surrounding areas, and the pulp necrosis stage and the size of the apical lesion were evaluated. For bacterial microbiota analysis, bacterial samples were obtained from the pulp cavity and apical region, respectively, and gDNA was collected. The collected gDNA was subjected to DNA sequencing using PCR techniques, and the taxonomic assignment of each pyrosequencing read was identified. Alpha diversity (Shannon index) was measured, and beta-diversity distance was measured to visualize the sample differences. The difference in bacterial flora between the G1W, G2W and G3W groups was statistically analyzed by the Kruskal-Wallis test. During the three-week observation, the pulp and periapical area showed a typical progress of apical periodontitis. From the histopathological analysis, pulp necrosis level extended from the pulp chamber toward the root apex as observation periods increased. Periapical lesion size which indicates periapical inflammation and alveolar bone destruction increased gradually over time. A total of 27 phyla, 645 genera, and 1276 species were identified. The root apex had a lower bacterial species diversity than the coronal pulp chamber. Remarkably, bacterial communities showed a tendency to change in the root apex based on the disease progression. When classifying the colony change of root apex at the phyla level based on gram staining, it can be seen that gram-negative bacteria account for the majority, but they are gradually decreasing, and gram-positive bacteria are increasing. Regarding the change of aerobic/anaerobic population at the species level, aerobic decreases and anaerobic increases with time, from first week to second week, showing a rapid change. In conclusion, this study confirmed the enlargement pattern of periapical lesions over time in the rat model by micro-CT and histopathologic analysis. The distribution of bacterial colonies changed over time in the pulp cavity and apex of rat molar. This study presented an experimental platform of rat apical periodontitis, which could be used for follow-up studies to understand the etiology of apical periodontitis through the changes in bacterial microbiota and develop the new treatment methods of the endodontic disease.

본 연구의 목적은 Rat 모델에서 치근단치주염의 시간 경과에 따른 변화를 방사선학적, 조직 병리학적 및 세균총 분석을 이용하여 분석하는 것이다. 6주령의 Sprague-Dawley rat을 치수노출을 포함하지 않는 대조군(n=2)과 세개의 실험군(n=6)으로 분배하였다 (G1W - 치수노출 후 1주 경과, G2W - 치수노출 후 2주 경과, G3W - 치수노출 후 3주 경과). 실험군은 zoletil 마취 하 #1/4 round bur를 이용하여 하악 제 1대구치의 치수를 노출한 후 1,2,3주간 구강 내에 노출시켰다. G3W그룹은 zoletil 마취 하, 매주 in-vivo micro CT를 촬영하고 mutual information-based 3-D registration technique을 이용해 일관된 위치에서 Region of Interest를 획득하고, k-means clustering method를 통해 치근단 병소의 부피변화를 정량분석하였다. 조직병리학적 분석을 위해 악골을 채취하여 탈회시킨 후 H&E 염색을 시행하여 치아 및 치아주변부위를 관찰하고, 치수괴사단계와 치근단 병소의 크기를 평가하였다. 세균총 분석을 위해 치수강과 치근단 부위에서 각각 bacterial sample을 획득하여, gDNA를 채취하였다. 채취한 gDNA는 PCR기법을 이용하여 DNA 염기서열분석을 진행하고, 각 pyrosequencing read의 taxonomic assignment를 파악하였다. Alpha diversity (Shannon index)를 측정하고, sample difference를 가시화하기 위해 beta-diversity distance를 측정하였다. G1W, G2W, G3W 그룹 간 세균총의 차이는 Kruskal-Wallis test로 분석하였다. 조직병리학적 분석 및 in-vivo micro-CT 분석 결과, 치근단 치주염의 시간 경과에 따른 치근단병소의 확대와 치조골파괴의 선형적 증가를 확인하였으며, 치근단 치주염 병소에서 염증의 단계적 변화를 조직학적으로 관찰하였다. Pyrosequencing 결과, 총 27개의 문, 645개의 속, 1276개 종의 세균총이 확인되었다. 세균총의 분포는 시간경과에 따라 치수강 및 치근단에서 변화를 보이며 특히 치근단에서 일관성있는 변화를 보였다. 이에 rat의 치수강보다 치근단에서의 세균총 분포와 변화는 치근단 치주염의 발생과정을 반영하는 지표로 판단할 수 있을 것으로 생각된다. Rat 치근단에서 세균총의 문 수준에서는 gram 음성균의 감소 및 gram 양성균의 증가, 종 수준에서는 호기성균의 감소, 혐기성균의 증가 양상이 관찰되었다. 결론적으로, 본 연구는 Rat 모델에서 치근단치주염 병소의 시간 경과에 따른 확대 양상을 방사선학적, 조직 병리학적으로 확인하였으며, rat 대구치의 치수강 및 치근단에서 시간경과에 따라 세균총 분포의 변화가 나타남을 확인하였다. 본 연구는 치근단치주염 병소의 유도와 함께 병소의 진행과정을 연구할 수 있는 실험플랫폼을 제시하였으며, 치근단치주염의 세균총 변화를 통한 병인에 대한 이해와 새로운 치료방법을 개발하는 후속연구에 이용될 수 있을 것이다.