The role of copine-7 and midkine in odontoblast differentiation and dentin formation

Abstract

치아 발생은 구강 상피조직과 신경능선 유래의 외배엽성 간엽조직의 상피-간엽 상호작용에 의해 순차적으로 조절된다. 상피-간엽 상호작용은 copine-7 (CPNE7)과 midkine (MK)을 포함하는 신호전달물질과 다양한 성장인자들이 관여한다. 선행 연구에 따르면 CPNE7과 MK는 상아모세포의 분화와 상아질 형성에 관여하는 것으로 알려져 있으나, CPNE7과 MK의 치아발생 과정 중의 정확한 발현 양상이나 상아모세포 분화과정과 상아질 형성과정에서의 작용기전은 지금까지 밝혀지지 않았다. 이 연구에서는 치아발생 과정 중 CPNE7의 시공간적 발현 양상을 확인하기 위하여 생쥐의 치아에서 CPNE7의 면역화학염색을 시행했다. 치아 발생 초기단계 (싹시기)에서 CPNE7은 치아상피조직에서는 발현하지만 간엽조직 에서는 발현되지 않았다. 그러나, 치아발생중반(종시기)에는 CPNE7 mRNA와 단백질이 치아 간엽조직인 치아유두에서 발현되기 시작했다. 그 이후, 치관형성 시기에서 CPNE7은 계속해서 치아 간엽조직의 분화 중인 상아모세포와 풋상아질에서 발현되지만, 치아 상피조직에서의 발현은 확연하게 감소되어졌다. 이러한 결과는 치아 상피조직에서 먼저 발현되어 분비된 CPNE7이 상피-간엽 상호작용을 통해 치아 간엽조직으로 이동하게 되고, 이것이 상아모세포의 분화와 상아질 형성을 유도한다는 것을 나타낸다. 또한, 뿌리 상아질 발생 동안에 CPNE7은 치아 상피 기원의 Hertwigs epithelial root sheath (HERS) 세포와 그리고 HERS 세포와 맞닿아 있는 치아 간엽 기원의 전상아모세포에서 발현했다. 이것은 CPNE7이 상피-간엽 상호작용을 통해서 치관 상아질의 형성뿐 아니라 뿌리 상아질의 형성에도 관여한다는 것을 나타낸다. 한편, 치아 발생이 끝난 치아에서는 CPNE7이 더 이상 치관 상아질과 뿌리 상아질 모두에서 발현하지 않았다. 자가포식작용은 세포 내에서 스스로 불필요한 세포 소기관 들이나 잘못 형성된 단백질들을 스스로 분해하는 과정으로 조직 발생, 세포 분화, 그리고 생존에 있어 필수적이다. 그럼에도 불구하고, 치아 발생 과정에서의 자가포식작용의 기능은 아직 밝혀지지 않았다. MK은 기존연구에서 상아모세포의 분화 촉진 뿐만 아니라 자가포식작용의 조절인자로도 알려져 있었다. 따라서 이 연구에서는 MK 매개의 상아모세포 분화와 자가포식작용과의 관련성을 확인해보고자 했다. 먼저 시험관내 연구에서 상아모세포의 분화과정 중에 자가포식작용의 대표적인 마커 단백질인 microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ (LC3-Ⅱ)와 MK의 발현양상이 유사한 결과를 확인했고, 실제로 MK은 상아모세포에서 LC3-Ⅱ의 발현양을 증가시켰다. 상아모세포에서 LC3를 면역형광법을 이용하여 자가포식 액포를 확인하였을 때에도, 아무것도 처리하지 않은 세포에서는 소량의 자가포식 액포가 확인되었지만, MK을 처리한 세포에서는 다량의 자가포식 액포가 확인됐다. 뿐만 아니라, 투과전자현미경을 통해 상아모세포의 초미세구조를 확인하였을 때에도 유사하게 MK을 처리한 세포에서 다량의 자가포식액포가 확인되었다. 특히, 자가포식작용을 억제하기 위해 3-methyladenine (3-MA)라는 자가포식작용 억제제를 처리했을 때 MK의 상아모세포 분화 촉진 기능이 손상됐다. 이것은 MK이 자가포식작용을 매개해서 상아모세포의 분화를 조절한다라는 것을 의미한다. 추가적으로, 생체 내에서 MK-매개 자가포식작용에 의한 상아모세포의 분화와 상아질 형성 작용을 확인했다. 생체 내에서의 MK의 작용을 확인하기 위하여, 치수가 노출된 생쥐 치아 손상모델을 제작했다. 손상부분에 아무것도 처리하지 않은 그룹에서는 세포가 함입된 소량의 경조직이 만들어진 반면, MK 처리군에서는 많은 양의 삼차상아질이 형성되었다. 특히, 새롭게 만들어진 삼차상아질 내에는 불규칙한 상아세관구조가 일부 확인되었다. 뿐만 아니라, 새로 형성된 상아질과 상아모세포에서는 dentin sialoprotein의 발현이 확인됐다. 한편, 자가포식작용을 저해한 그룹들(3-MA 단독처리군, 3-MA와 MK을 함께 처리한 군)에서는 상당한 양의 세포자멸사가 확인되었고, 새로운 경조직도 형성되지 않았다. 또한, 이 연구에서는 치아 형태 형성과정 동안에 MK과 자가포식작용의 기능을 확인하기 위하여 체외에서 생쥐 치배를 배양했다. 11일 된 생쥐 배아에서 추출한 치배를 광학현미경에서 관찰했을 때 뇌상기인 것이 확인되었고, 체외배양 5일 후에 종상기의 치배로 발달한 것을 확인했다. 대조군과 MK처리군에서는 분화중인 상아모세포와 법랑모세포가 관찰되는 전형적인 종상기 치배의 형태가 확인됐다. 하지만, MK의 발현을 감소시킨 치배에서는 상아모세포의 극성이 사라지고, 비정상적인 형태가 관찰됐다. 자가포식작용을 완전 차단한 3-MA처리군에서는 이보다 훨씬 심각한 치배의 결손이 확인됐다. 종합해 볼 때, 이 연구에서는 상아모세포 분화과정 및 상아질 형성과정에서의 CPNE7과 MK의 정확한 발현양상과 그 작용기작을 확인했고, 또한, 치아발생과정에서의 자가포식작용의 중요성을 처음으로 제시하였다.

Interactions between the ectodermal and mesenchymal tissues are the basis of the central mechanism regulating tooth development. I previously reported that the diffusible signaling molecule copine-7 (CPNE7) is secreted by preameloblasts, and the CPNE7-NUCLEOLIN complex regulates the differentiation of mesenchymal cells of dental or non-dental origin into odontoblasts. However, the precise expression patterns of CPNE7 in the stages of tooth development have not yet been elucidated. The aim of the present study was to establish the spatiotemporal expression pattern of CPNE7 during mouse tooth development. I investigated the distribution of CPNE7 in the embryonic and postnatal developing mouse tooth. During the initiation stage (bud stage), CPNE7 expression was detected in the dental epithelium but not in the mesenchyme. At E19 (bell stage), CPNE7 was expressed in preodontoblasts. At P7 (crown formation stage), CPNE7 was localized in differentiating odontoblasts but was no longer detected in ameloblasts. These findings suggest that CPNE7 secreted by preameloblasts translocated to preodontoblasts in concert with the epithelial-mesenchymal interaction. CPNE7 was expressed in differentiating odontoblasts and the odontoblast process during dentin formation, but was absent in mature functional odontoblasts. Furthermore, CPNE7 was expressed in the Hertwigs epithelial root sheath (HERS) and in the facing preodontoblasts during root dentin formation. Taken together, these results illustrate the dynamic expression of CPNE7 during dentinogenesis and suggest its important function in various stages of tooth development.