Applications and Bactericidal Effects in Different Types of Plasma-Activated Water

Abstract

최근 살균 및 소독제로서 플라즈마 활성수를 다양한 형태로 응용하는 연구들이 진행되고 있다. 특히 실용적인 측면에서 플라즈마 활성수를 스프레이 및 버블 등의 형태로 응용하거나 초음파와 같은 다른 기술들을 접목하여 살균 효율을 증진시키기 위해 노력하고 있다. 따라서, 본 연구에서는 플라즈마 활성수의 활용성을 증진시키기 위한 응용과 각각의 살균 기작을 구명하기 위하여 1) 아크 방전 플라즈마에 의해 생성된 플라즈마 활성 분무액의 병원성 미생물 살균효과 및 살균 기작을 조사하고, 2) 플라즈마 버블의 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 살균에 기여하는 핵심 활성종과 유기물의 영향을 확인하고, 3) 스테인리스 강 표면에 접종된 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대하여 청색광과 플라즈마 활성수가 시너지 살균작용을 나타낼 수 있는지를 검증하였다. 실험 Ⅰ에서는 아크 방전 플라즈마에 의해 생성된 플라즈마 활성 분무액의 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 대장균 O157:H7 (Escherichia coli O157:H7)에 대한 살균 효과와 살균 기작을 조사하였다. 플라즈마 방전을 위해 0.9% NaCl (w/v) 용액을 급수로 사용하였다. 플라즈마 활성 분무액은 주로 과산화수소와 하이포아염소산이온으로 구성되어 병원성 미생물에 대한 살균작용에 기여하는 것으로 사료된다. L. monocytogenes와 E. coli O157:H7을 각각 플라즈마 활성 분무액에 반응시킬 경우 5분 이내에 각각 3 및 4 log 수준만큼 살균되었다. 반면, 플라즈마 활성 분무액을 1분 처리하였을 경우 L. monocytogenes는 0.58 log 살균되었으나, E. coli O157:H7은 4.13 log 살균되어 서로 다른 살균양상을 나타내었다. DNA-결합 형광 염료인 SYTO 9 및 propidium iodide (PI)를 사용하여 미생물 세포막의 온전성 변화를 측정한 결과, 플라즈마 활성 분무액을 5분 처리하였을 경우 대다수의 L. monocytogenes 및 E. coli O157:H7 세포들이 PI와 반응하여 세포벽과 세포막이 손상되었음을 확인할 수 있었다. 반면, 플라즈마 활성 분무액을 1분 처리하였을 경우에는 E. coli O157:H7 세포에 비하여 L. monocytogenes 세포의 세포막 손상이 적었다. 투과전자현미경 분석 결과 L. monocytogenes 및 E. coli O157:H7 모두 플라즈마 활성 분무액 처리에 의하여 세포 내 물질들이 일부 변성되거나 세포 외부로 누출되는 현상의 형태학적 변화를 확인할 수 있었다. 플라즈마 활성 분무액 내 화학종들이 세포 외 구조물을 통과하거나 손상을 입혀 세포 내 물질들에 영향을 미칠 수 있으며 L. monocytogenes가 E. coli O157:H7과 비교하여 상대적으로 플라즈마 활성 분무액에 덜 민감한 것으로 사료된다. 실험 Ⅱ에서는 저온 플라즈마 버블의 S. Typhimurium 살균작용에 기여하는 핵심 활성종과 유기물의 영향을 조사하였다. 플라즈마는 유전체 장벽 방전을 통해 발생시켰으며, 오존이 주요하게 발생되어 버블의 형태로 용액(400 mL)에 주입되었다. S. Typhimurium 생균수는 플라즈마 버블의 처리시간이 늘어남에 따라 유의적으로 감소하여 처리시간 5분 기준으로 약 5.29 log 살균되었다. 핵심 활성종을 구명하기 위하여 오존가스 제거 장치(ozone destruction unit)와 유리기 포촉제(radical scavenger)를 사용하여 검증시험을 진행하였다. 실험 결과, S. Typhimurium 살균작용에는 일중항산소가 주요하게 기여하고, 이러한 일중항산소의 생성에는 오존으로부터 생성되는 초과산화물 음이온 라디칼의 존재가 필수적인 것으로 사료된다. 육추출물과 펩톤으로 구성된 유기물을 농도별(0, 0.005, 0.05, 0.1, 그리고 0.5 g/L)로 준비하여 S. Typhimurium을 접종한 후 플라즈마 버블을 5, 10, 15, 20, 25, 그리고 30분 처리한 결과 살균 효율은 유기물 농도 의존적으로 감소하였으나, 일부 농도 조건을 제외하면 더 긴 처리시간을 통하여 성공적인 살균작용을 나타낼 수 있었다. 실험 Ⅲ에서는 스테인리스 강 표면에 접종된 S. aureus에 대하여 청색광 처리가 플라즈마 활성수의 살균 효율을 증진시킬 수 있는지를 조사하였다. 청색광 처리는 발광 다이오드(중심파장, 466 nm; 광도, 18.74 mW/cm2)를 이용하였고, 플라즈마 활성수 처리는 캡슐화된 대기압 플라즈마 발생기(2.2 kHz, 4.2 kV)를 이용하였다. 스타필로잔틴에 청색광을 처리하였을 경우 460 nm 흡광도 값은 조사량(0, 30, 60, 90, 그리고 150 J/cm2)이 증가할수록 유의적으로 감소하였으며, 150 J/cm2 조건에서 완전히 투명해졌다. 청색광(150 J/cm2)과 플라즈마 활성수(10분)를 S. aureus 현탁액에 복합 처리하였을 경우 약 2.70 log 살균되었으며 이는 플라즈마 활성수 단일 처리군과 비교하여 약 40배 수준이었다. 또한, 플라즈마 방전 종료 후 10분간 방치시킨 결과 S. aureus 생균수는 복합 처리군에서 검출되지 않아(검출한계, 1 log CFU/mL) 대조군 대비 6.66 log 이상의 살균효과를 나타내었다. S. aureus 세포에 대한 청색광(150 J/cm2) 단일처리에 의해 260 및 280 nm 흡광도 값이 증가하여 세포막 섭동에 의한 세포 내 물질의 누출 가능성을 확인하였으며 손상된 세포막만 통과할 수 있는 SYTOXTM green의 침투에 의한 형광 신호의 증가를 마찬가지로 확인할 수 있었다. S. aureus가 접종된 스테인리스 강에 대해서도 마찬가지로 청색광(150 J/cm2)과 플라즈마 활성수(15분) 복합 처리에 의한 시너지 살균 효과를 확인할 수 있었다. 본 연구 결과, 병원성 미생물을 제어하기 위하여 플라즈마 활성수를 분무액 및 버블의 형태로 응용할 수 있었고, 또 다른 비가열 기술인 청색광에 응용하여 플라즈마 활성수의 활용성 증진의 가능성을 확인하였고, 각각의 살균 기작을 검증하였다. 플라즈마 활성수는 다양한 형태로 응용될 수 있으며, 병원성 미생물에 대한 플라즈마 활성수의 명확한 살균 기작을 구명함으로써 식품 산업을 포함하여 다양한 분야에서 유망한 살균·소독제로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

Overall Summary

A series of research results have been reported for the possible application of plasma-activated water (PAW) as a highly effective measure of pasteurization process. In the application perspective, there are various approaches including addition of chlorine, spray, micro- or nano-bubbles, and ultrasound-assisted synergy to make more effective and feasible. In addition, it is very important to understand the mechanism of action of the PAW in different forms of application. Therefore, the present experiments were conducted 1) to investigate the bactericidal effect and its mechanism of plasma-activated droplets generated from arc discharge plasma, 2) to identify the key reactive species and influence of organic matter for inactivating Salmonella Typhimurium by plasma bubbles, and 3) to confirm the possibility of synergistic bactericidal action between blue light and PAW against Staphylococcus aureus on stainless steel surfaces.

Experiment I. Antimicrobial effects and mechanism of plasma-activated droplets produced from arc discharge plasma on Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157:H7 In this study, the antimicrobial effects of plasma-activated droplet (PAD) produced from arc discharge plasma on planktonic Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157:H7 was investigated. NaCl (0.9%, w/v) was used as the feeding solution for the plasma discharge. The inactivation mechanism of the PAD treatment was also investigated. PAD mainly contains H2O2 and OCl-, which play a significant role in the inactivation process against L. monocytogenes and E. coli O157:H7. The population of L. monocytogenes and E. coli O157:H7 was significantly reduced by approximately 3 and 4 log units, respectively, within 5 min of PAD exposure. However, the bactericidal effects of PAD against L. monocytogenes and E. coli O157:H7 showed different trends by showing 0.58 and 4.13 log reductions, respectively, after 1 min of PAD exposure time. The change of membrane integrity was evaluated using two DNA-binding fluorescence dyes, SYTO 9 and propidium iodide (PI). The breakage of the cell wall and membrane of both microorganisms was evidenced by the uptake of PI by cells after 5 min of PAD exposure, but the effect was less in L. monocytogenes compared to E. coli O157:H7 after 1 min of PAD exposure time. The transmission electron microscopy results clearly showed morphological changes in both microorganisms, including denaturation or leakage of intracellular materials as a consequence of PAD treatment. These findings suggest that PAD-induced chemical species can eventually affect the intracellular materials of bacterial cells by passing through or attacking the cell envelope. In addition, L. monocytogenes is less susceptible to PAD compared with E. coli O157:H7.

Experiment II. Inactivation of Salmonella Typhimurium by non-thermal plasma bubbles: Exploring the key reactive species and influence of organic matter The key reactive species generated by non-thermal plasma bubbles for the inactivation of Salmonella Typhimurium and the effects of organic matter on the inactivation efficacy were investigated. Plasma, which is primarily composed of ozone (O3), was generated by dielectric barrier discharge and injected into a solution as a bubble. The population of viable S. Typhimurium decreased in proportion to the treatment time, resulting in a 5.29 log reduction after 5 min of treatment. Verification tests to specify key reactive species were conducted using an O3 destruction unit and reactive oxygen species scavengers. The results indicated that singlet oxygen (1O2) contributes substantially to the inactivation of S. Typhimurium, and that the presence of superoxide anion radicals (O2·-) from O3 is essential for the production of 1O2. When a S. Typhimurium suspension containing organic matter (final concentration: 0, 0.005, 0.05, 0.1, and 0.5 g/L), consisting of beef extract and peptone, was treated with plasma bubbles for 5, 10, 15, 20, 25, and 30 min, respectively, the potential of the plasma bubbles for inactivating S. Typhimurium successfully was verified with longer contact time, despite organic matter attenuating the inactivation efficiency in a dose-dependent manner.

Experiment III. Blue light promotes bactericidal action of plasma- activated water against Staphylococcus aureus on stainless steel surfaces The study was conducted to investigate the effects of blue light on the enhancement of bactericidal effect of plasma-activated water (PAW) against Staphylococcus aureus on stainless steel surfaces by inducing the photolysis of staphyloxanthin (STX). A light-emitting diode (LED; central emission wavelength, 466 nm; light intensity, 18.74 mW/cm2) was used for blue light treatment, and encapsulated atmospheric pressure plasma generator (2.2 kHz, 4.2 kV) was applied for PAW treatment. When STX extract was treated with blue light (0, 30, 60, 90, and 150 J/cm2), the absorbance value at 460 nm significantly decreased in a dose-dependent manner, and became completely transparent at dose of 150 J/cm2. After combined treatment with blue light (150 J/cm2) and PAW (10 min), the surviving population of S. aureus decreased by 2.70 log CFU/mL, which was about 40 times higher than that after plasma single treatment. In addition, 10 min of post plasma treatment in combined treatment group showed more than 6.66 log CFU/mL reduction compared to the control group, resulting in non-detectable levels (detection limit: 1 log CFU/mL). Blue light (150 J/cm2) treatment increased the absorbance values at 260 and 280 nm, indicating the possibility of damage to cell membranes, which was also identified by an increase in the SYTOXTM green fluorescence signal. The synergistic bactericidal effect of blue light (150 J/cm2) and PAW (15 min) against S. aureus was also observed in stainless steel coupons.