Mutational analyses of NfnB, a dinitroaniline herbicide-catabolizing nitroreductase

Abstract

Nitroreductases are attractive enzymes for biotechnologies in that various compounds serve as substrates to that proteins. Recently, a dinitroaniline herbicide(s) degrading enzyme, NfnB was identified and proposed to its functional role toward butralin and pendimethalin with narrow substrate specificity. The crystal structure of NfnB was determined with coenzyme FMN in the laboratory of Professor Rhee. Dimeric enzyme, NfnB, has a protruding middle region for Val75‒Tyr129 which forms an opening wall of substrate binding pocket and is responsible for substrate specificity. Mutational analyses for the residues in the protruding middle region reveal that Tyr88 and Arg100 are the key residues for dinitroanline herbicide(s) and another substrate NADPH as an electron donor, respectively. In particular, Tyr88 mutants, Y88A and Y88F, appear enhanced kinetic parameters with about 2‒3-fold and 11‒29-fold increased catalytic efficiencies (i.e., kcat/Km) toward butralin and pendimethalin, respectively, relative to the wild-type NfnB, as well as emerged enzyme activities toward oryzalin and isopropalin which have no activities for the wild-type NfnB. Furthermore, The crystal structures of Tyr88 mutants elucidate improved and broadened substrate specificity of them by exhibiting reduced steric hindrance and electrostatic features relative to the wild-type NfnB. This study indicates that mutational approaches can manipulate the substrate specificity of nitroreductase and provides insights for further applications such as bioremediation, biocatalysis and even clinical methods.

여러 종류의 기질을 가지는 Nitroreductase는 생물공학적 측면에서 흥미로운 효소이다. 최근, 한 연구팀에 의해 디니트로아닐린 계열의 제초제인 butralin과 pendimethalin에 대한 기질특이성만을 갖는 NfnB라는 nitroreductase가 보고되었으며, 보조인자인 FMN과 결합한 NfnB의 결정 구조는 본 실험실에서 규명하였다. 이량체인 NfnB에서 protruding middle region이라 불리는 Val75‒Tyr129 구간은 기질 결합 pocket의 입구를 형성하고 기질특이성을 결정 짓는 역할을 한다. 그리고 protruding middle region의 잔기에 대한 돌연변이체 분석을 통해 Tyr88은 디니트로아닐린 계열의 제초제의 결합에, Arg100은 NfnB의 또 다른 기질인 NADPH의 결합에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혔다. 특히 Y88A와 Y88F 돌연변이체는 야생형 NfnB와 비교했을 때, butralin과 pendimethalin에 대해서 각각 2~3배, 11~29배 증가한 효소 효율을 (즉, kcat/Km) 보였다. 또한, 야생형 NfnB에서는 효소 활성이 없던 oryzlain과 isopropalin에 대해서는 효소 활성을 나타냈다. 야생형 NfnB에 비해 입체 장애와 정전기적 특성이 감소한 두 돌연변이체의 결정 구조는 이들의 넓어진 기질특이성을 설명할 수 있다. 본 연구는 돌연변이를 통해 nitroreductase의 기질특이성을 조절할 수 있음을 보여주고, 이는 향후 생물학적 환경정화, 생체 촉매 반응, 치료제 개발 등과 같은 응용 단계를 위한 기초 연구가 될 수 있다.