Structure and function of the bacterial autolysin SagA from Brucellosis-causing pathogen

Abstract

Lysozymes have been employed to defend the invading bacteria in mammalian fluids. Due to its antimicrobial effects, hen egg-white lysozyme (HEWL) has been used as food additives to control the bacteria. However, its limited antimicrobial efficacy against Gram-negative bacteria restricts its application in the food industry. Intracellular pathogenic bacterium Brucella abortus equips with the type IV secretion system (T4SS) spanning the peptidoglycan layer. A recent genetic study with B. abortus revealed secretion activator gene A (SagA) as an autolysin component creating pores in the peptidoglycan layer and peptidoglycan hydrolase inhibitor (PhiA) as a proteinous inhibitor of SagA. In this study, I determined the crystal structures of both SagA and PhiA. Notably, the SagA structure contained a peptidoglycan fragment in the substrate-binding site space between the N-terminal and C-terminal domains. Comparison with the homologous TtsA structure suggested that the substrate-dependent hinge-motion of the N-terminal domain of SagA. I next evaluated the hydrolyzing activity of SagA biochemically. The purified SagA fully hydrolyzed the DAP-type peptidoglycan at a higher activity than HEWL. However, SagA partially digested the Lys-type peptidoglycan in a potent product inhibition mode. Moreover, SagA exhibited only a very weak or no activity on the modified peptidoglycans. The crystal structure of the SagA-peptidoglycan complex, combined with the biochemical results, suggested that the molecular mechanism for the substrate-binding mode of SagA. When combined with an outer membrane permeabilizing agent, SagA showed higher antimicrobial activity than HEWL against Gram-negative bacteria. The crystal structure of PhiA revealed in this study showed that the PhiA protein exhibited the tetrameric assembly with a similar structural fold to a lysozyme inhibitor framily proteins such as MliC and PliC. However, the purified PhiA protein failed to inhibit SagA activity, unlike the previous results from the genetic study. Structural information of PhiA could contribute to revealing the function of PhiA. In conclusion, this study revealed high-resolution structures of SagA and PhiA. I analyzed the biochemical characteristics of SagA and suggested the substrate-binding mode of SagA, accompanied by a hinge motion. These findings would give implications to the molecular basis for the SagA-PhiA system of B. abortus. Inhibitors designed based on the structural information would contribute to controlling brucellosis by abolishing the T4SS. Furthermore, SagA has a high potential in development as an efficient food additive to kill food-borne pathogens contaminated during food processing.

라이소자임은 포유동물의 체액에서 세균을 방어하기 위해 사용된다. 라이소자임은 항균 효과로 인해 세균을 억제하기 위한 식품 첨가물로 이용되어 왔으나, 그람음성균에 대한 항균 효과가 부족하기 때문에 식품 산업에서의 활용이 제한되어 왔다. 세포 내 병원성 박테리아인 브루셀라는 펩티도글리칸 층에 걸쳐있는 Type IV secretion system (T4SS)을 가지고 있다. 최근 연구에 따르면, 소유산균 (Brucella abortus)의 secretion activator gene A (SagA)는 펩티도글리칸에 구멍을 만드는 자가분해효소로 알려져 있으며, peptidoglycan hydrolase inhibitor A (PhiA)는 SagA의 단백질계 억제제로 알려져 있다. 본 연구에서는 SagA와 PhiA의 결정 구조를 모두 규명하였다. SagA의 구조에서는 N-말단 도메인과 C-말단 도메인 사이의 기질 결합 부위에 펩티도글리칸의 조각이 결합한 구조를 볼 수 있었고, SagA와 상동성을 가지는 TtsA 구조와 비교를 통해 기질 결합에 의한 N-말단 도메인의 회전 운동을 제시할 수 있었다. 다음으로 SagA의 가수분해 활성을 분석하기 위해 생화학실험을 수행하였다. SagA는 DAP 형 펩티도글리칸을 완전히 가수 분해했으며, 이는 난백 유래의 라이소자임보다 좋은 활성을 나타냈지만, 라이신 형 펩티도글리칸에 대해서는 생성물에 의한 강한 억제 반응에 의해 일부만을 가수분해하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 변형된 펩티도글리칸에 대해서는 활성이 아주 약하거나 없었다. 펩티도글리칸과 SagA의 복합체 구조와 생화학적 실험 결과를 토대로 SagA의 기질 결합 방식에 대한 분자적 기전을 제시할 수 있었다. PhiA의 결정 구조는 PhiA가 MliC와 PliC와 같은 라이소자임 억제제 계열의 단백질들과 유사한 구조를 가지며, 사량체 구조 가진다는 것을 나타냈다. 기존의 유전적 연구 결과와는 달리, PhiA가 SagA의 활성을 억제하는 것은 관찰할 수 없었지만, PhiA의 구조적 정보는 PhiA의 기능을 밝히는데 기여할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 SagA와 PhiA의 고해상도 구조를 규명하였다. SagA의 구조와 활성 실험 결과를 통해 SagA의 생화학적 특성을 분석하고 기질 결합 방식을 제시할 수 있었다. 이러한 발견을 토대로 소유산균의 SagA-PhiA 시스템의 분자 기전을 밝히는데 기여할 것으로 판단된다. SagA의 구조에 기반하여 설계된 SagA의 억제제를 통해 T4SS를 약화시켜서 브루셀라병을 제어하는데 기여할 수 있을 것이다. 또한, SagA는 식중독균을 죽이는 효율적인 식품 첨가물로의 개발 가능성이 있다.