A synthesis of nanoparticle from technical lignin for drug delivery system

Abstract

There has been growing interest in lignin as a promising source for drug delivery system preparation in recent years. The lignin-based nanoparticle has the potential to be preferably used because of its controllable intracellular uptake and stimuli-controlled drug-releasing ability. However, few research investigated the effect of structural characteristics of lignin on the synthesis of nanoparticles and its essential features such as size, colloidal stability, and biocompatibility. This research focuses on how the molecular structures of technical lignin (kraft and alkaline/soda lignin) affect the lignin nanoparticle properties. Based on these results, drug-encapsulated lignin nanoparticles were synthesized, and those drug-releasing efficiencies were investigated through evaluation of in vitro and in vivo biocompatibility. First, lignin fractions with different molecular weights (Mw 1,460 ~ 12,900), phenolic hydroxyl group (total 3.7 ~ 6.2 mmol g-1), and main internal linkages (β-O-4, β-β, and β-5) were obtained by performing a sequential solvent extraction of kraft lignin (KL). Subsequently, spherical lignin nanoparticles (KLNPs, i.d. 193 ~ 1,039 nm) were synthesized by the nanoprecipitation process. The low-molecular-weight KL fractions generated KLNPs with a relatively enlarged diameter but less size-distributed. Further analysis showed that molecular weight, total, and phenolic hydroxyl group content in the lignin highly correlated with nanoparticle size. Every KLNPs exhibited comparable and good colloidal stability (-44.5 ~ -29.1 mV). Cell viability and hemotoxicity assessments revealed higher and sustained biocompatibility of KLNPs even at a high concentration, at least for three days. Second, KL was utilized as a polymer for the drug-encapsulated nanoparticle (ELNP) synthesis. Successful drug encapsulation of ELNPs by nanoprecipitation was determined (max. 59% for coumarin 6 and max. 73% for doxorubicin (DOX)). Compared to KLNP, the size (i.d. 176 ~ 469 nm) and surface charge (-40.5 ~ -32.7 mV) of ELNP showed no remarkable change regardless of introducing the drug in the particle. The drug release profile of ELNPs was faster in the relatively acidic condition (over 70% within 0 ~ 4 h) than the neutral (less than 50% within 0 ~ 4 h). In vitro cytotoxicity assay revealed the drug release effect of ELNPs, delaying but not decreasing the anticancer activity. In addition, the hemocompatibility test, in vivo allergic reaction test, and tumor inhibition assays using mice tumors showed high ELNP biocompatibility and side effect reduction during the chemotherapy. Lastly, alkaline/soda lignin (AL) was sequentially solvent-extracted, or its phenolic hydroxyl groups were chemoselectively methylated. These lignins with the modified structure were handled to form nanoparticles (ALNP) to clarify the effect of the lignin structure on the physical properties of nanoparticles. Pure ALNPs were obtained from neat lignin, solvent-extracted fractions (ALNP-Fs, i.d. 414 ~ 1,214 nm), and methylated lignins (ALNP-Ms, i.d. 516 ~ 721 nm). Specifically, the size properties of ALNP-Ms showed a very high negative correlation (R2 = 0.95) with the phenolic hydroxyl group amount. It indicates that the phenolic hydroxyl groups in lignin are the main structures that affect the nucleation and/or condensation during the nanoprecipitation process. ALNPs exhibited high colloidal stability (-42.3 ~ -32.7 mV), and most of them also showed good in vitro biocompatibility.

최근 리그닌을 약물 전달 시스템의 재료로 이용하는 연구가 주목받고 있다. 특히 리그닌으로 나노입자를 제조하는 연구는 약물 수송 및 방출 조절에 관한 장점을 부여할 수 있어 선호되는 추세이다. 하지만 그중 리그닌의 구조적 특성이 나노입자의 형성 과정이나 물성(크기, 콜로이드 안정성, 생체안전성)에 미치는 영향에 주목한 연구는 거의 없는 실정이다. 본 연구에서는 산업공정 부산물로 발생하는 리그닌 부산물의 구조적 특성이 리그닌 나노입자의 물성에 미치는 영향을 이해하고자 하였다. 해당 결과를 바탕으로 약물 저장 리그닌 나노입자를 합성하여 약물 방출 특성과 기대 효과를 생체외 및 생체내 조건에서의 생체안전성 실험을 통하여 구명하였다. 우선 산업공정 부산물인 kraft 리그닌을 순차적 용매 분획화하여 분자량, 수산기 함량, 분자간 주요 결합 함량이 각기 다른 5개 분획으로 분리하였다. 각 리그닌 분획으로부터 THF-리그닌 용액과 증류수의 치환에 의한 나노침전법을 통하여 나노입자를 획득하였으며 입자 크기는 최소 193 nm에서 최대 1,039 nm로 다양하게 나타났다. 리그닌 분자량이 작을수록, 페놀성 수산기 함량이 높을수록 크면서 균질한 분포를 보이는 입자가 형성되었으며 kraft 리그닌의 구조적 특성과 형성된 나노입자의 입자 크기와 분포는 리그닌 분자량과 수산기 함량, 특히 페놀성 수산기 함량에 영향을 받는 것으로 판단되었다. 나노입자는 대체로 깔끔한 구형으로 형성되었으며 증류수에 안정적인 콜로이드 상태로 분포하였다(-44.5 ~ -29.1 mV). 세포 생존율 및 혈구독성 평가 결과 리그닌 나노입자는 높은 농도 조건에서도 최소 3일간 높은 수준의 지속적인 세포안전성을 보이는 것을 확인하였다. 위 결과를 바탕으로 선택한 특정 리그닌 조건으로부터 약물 저장 나노입자를 합성하였으며 약물 방출 조절 효과를 입증하기 위한 실험을 수행하였다. 약물 저장 리그닌 나노입자는 coumarin 6에 대하여 최대 59%, 독소루비신에 대하여 최대 73%의 약물 저장 효율을 나타내었다. 약물 저장 리그닌 나노입자의 크기(176 ~ 469 nm)는 대조군과 비교하였을 때 약물 첨가에 큰 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 또한, 약물 저장 여부는 나노입자의 콜로이드 안정성에도 영향을 미치지 않았다. 약물 저장 리그닌 나노입자는 대체로 0 ~ 4시간 사이에 빠른 약물 방출 경향을 보였고 혈액과 동일한 pH 조건보다는 산성 조건에서의 약물 방출이 더 빠른 것으로 나타났다. 리그닌 나노입자는 생체외 혈구독성 실험과 생체내 알레르기 반응 실험에서 우수한 생체안전성을 나타냈으며, 생체외 세포독성 실험과 생체내 항암효과 검증 실험에서 약물 방출 조절 및 부작용 경감에 의한 사망률 감소 효과를 나타냈다. Alkaline/soda 리그닌의 경우 순차적 용매 분획화와 별도로 페놀성 수산기의 메틸화 반응을 수행하여 분자량의 변화가 상대적으로 적으면서 페놀성 수산기의 함량이 각기 다른 4개 그룹을 추가로 획득하였다. 구조적 변형을 거친 해당 리그닌 그룹으로부터 나노입자를 획득하여 그 물성을 분석한 결과, 분획화 리그닌 유래 나노입자는 kraft 리그닌에서와 유사한 크기 분포 경향을 보였다. 반면, 메틸화 리그닌 유래 나노입자는 페놀성 수산기가 감소함에 따라 크기가 감소하는(721 ~ 516 nm) 뚜렷한 경향을 보였다. 모든 조건에서 나노입자의 콜로이드 안정성은 높게 유지되었으며 생체안전성 역시 대부분 농도 및 시간 조건에서 안전성을 나타냈다. 본 연구에서는 펄프 및 바이오에탄올 생산공정에서 부산물로 발생하는 리그닌의 고부가가치 활용방안으로 약물 방출 조절 나노입자 합성을 제시하였다. 리그닌의 구조적 특성과 나노입자 물성의 상관성을 구명하여 본 연구에서 다루지 않은 다른 리그닌을 이용한 나노입자 제조 및 물성 제어에 있어서도 단초를 제공하였으며, 생체외 및 동물 실험을 통한 리그닌 나노입자의 약물 방출 조절 및 부작용 경감 효과를 검증하여 약물 전달체 원료로써 실제 적용 가능성을 제시하였다.