Genome-wide analysis of alternative splicing complexity in Magnaporthe oryzae during infection

Abstract

최근 RNA 시퀀싱(RNA-sequencing) 분석 기술의 발달과 전사체 데이터의 축적으로 인해 심층적인 전사체 분석이 가능하게 되었다. 이런 전사체 분석은 각각의 유전자들이 전사서열의 조절을 통해 조절되고 있음을 밝혀주었다. 그 조절기작 중 대표되는 것은 선택적 스플라이싱(alternative splicing)으로 이러한 방법들은 하나의 유전자에서 이형의 전사서열(isoform)을 만듦으로써 유전자의 발현과 단백질 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다. 인간과 식물에서 유전체의 선택적 스플라이싱 메커니즘은 세포 분화, 환경 적응 및 각종 스트레스에 대응하기 의해 조절되는 것으로 밝혀졌었는데, 병원균 감염 역시 선택적 스플라이싱을 사용하여 식물에서 전사체 네트워크를 재구성하는 요인 중 하나로 알려져 있다. 그러나 선택적 스플라이싱 다양화는 주로 식물 전사체에 초점을 맞추고 있으며, 미생물-식물 상호작용에서 식물병원균 전사체의 선택적 스플라이싱 연구는 거의 이루어지지 않았다. 그러므로 위 조절기작의 곰팡이 유전체에서 연구는 곰팡이 병원체가 식물 방어 시스템을 어떻게 상쇄하거나 극복하는지에 대한 단서를 얻는 데 필요하다. 해당 연구는 곰팡이 시스템의 반응을 이해하기 위해 벼 감염시 벼도열병균(Magnaporthe oryzae)의 선택적 스플라이싱 레퍼토리를 프로파일링(profiling)했다. 특히 곰팡이 균사생장 또는 다양한 기주감염 단계에서의 레퍼토리의 동정은 병 진전 과정을 시간대별로 이해하기 위한 다각적인 전사체를 구축했다. 그 결과 선택적 스플라이싱에 의해 생기는 이형 전사서열은 균사생장시기에 비해 기주감염시기 동안 증가하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 특히 기주감염 단계에서 특이적인 이형 전사서열은 곰팡이가 기주 세포의 침투한 직후 단계부터 활물기생성 시기동안 증가하였는데, 이후 사물기생성 단계에서는 특이적인 이형 전사서열의 숫자가 감소한다는 것을 밝혔다. 이러한 조성의 차이를 기반하여 병 진전 과정 동안 특이적 스플라이싱 유도는 기주 세포와의 상호작용과 상관관계가 있음을 밝혔다. 이 기작을 잘 이해하기 위해서는 선택적 스플라이싱이 단백질 기능을 변화하는 방법에 대한 이해가 필요하다. 선택적 스플라이싱의 역할에는 두 가지 주요 개념이 있다. 하나는 논센스 서열에 의한 전사서열의 분해(Nonsense-Mediated Decay)이고 다른 역할은 단백체의 다양성을 증가시키는 것이다. 이 연구에서는 선택적 스플라이싱의 두 가지 주요 역할을 고려해 잠재적 NMD 후보와 단백질 번역 후보를 나눴다. 특히, 다수의 인트론 잔류(intron retention)는 NMD를 유발하는 요인임을 밝혔다. 또한 NMD가 일어나지 않는 서열인 단백질 번역후보에서 우리는 기능 도메인(protein domain) 구조 변화 및 분비와 관련된 서열의 변화를 가진 단백질을 확인함으로써 기능 도메인에서의 단백질 변이와 분비단백질의 분비구조의 변이를 찾았다. 이는 감염 동안 단백질의 잠재적인 기능의 변화를 유도할 것으로 판단된다. 이 연구는 전체 기주감염 과정에 걸쳐 선택적 스플라이싱 레퍼토리를 제공하며 벼도열병균에서 병원성 및 환경 신호의 적응에 대한 분자생물학적 연구의 기반을 제공할 것이다. 더욱이 위 레퍼토리의 단백질 예측은 곰팡이 유전체에서 다면발현(pleiotrophy)의 개념을 제안한다. 종합적으로, 이러한 선택적 스플라이싱 전사체는 기주-병원균 상호 작용 동안 곰팡이 선택적 스플라이싱 전사체의 복잡성에 대한 식견을 제공할 것이다.

The recent advancement of RNA sequencing technology and the accumulation of transcriptome has enabled comprehensive transcriptome research. Transcriptomic analysis revealed that gene is controlled by post-transcriptional regulation. One of the post-transcriptional regulating mechanisms is alternative splicing (AS). This mechanism is known to modulate gene expression and protein function. In human and plant genomes, the AS mechanism was revealed to be regulated by cell differentiation, environmental adaptation, and assorted stress cues. The pathogen also has been understood as a cue to induce AS reprogramming of transcriptome networks in the plant genome. However, previous study of AS diversification has focused on plant transcriptome, and the AS mechanism of the pathogen during microbe-plant interaction was poorly understood. Therefore, profiling of AS diversification in the fungal genome is necessary to decipher how fungal pathogens counteract or overcome the innated plant defense system. This study profiled the AS repertoire of Magnaporthe oryzae during rice-infection to understand the response of the fungal system. Especially the identification of AS repertoire from diverse development or infection stages provides the multifaceted transcriptome to understand the temporal infection process. These AS repertoires increased during the whole infection compared to vegetative growth stages. Moreover, the specific AS isoform in the early infection stages increased after the fungus penetrated a host cell, which continued up to the biotrophic stages and decreased in necrotrophic stages. This compositional pattern suggests that the AS repertoire correlated to the fungal lifestyle during the infection process. To decipher the roles of AS, understanding the post-transcriptional process of isoforms needs to follow. This study considered the two major AS roles, the nonsense-mediated decay (NMD) and protein diversification. In the roles of NMD, we found that majority of intron retention could regulate transcript decay. Subsequently, we identified proteins with domain structure transitions and alteration of secretion structure at potential translated isoforms. These protein variations in a functional region provide the clues of neo-functionalization in proteome during infection. This study provides the AS repertoire throughout the infection process and will provide a foundation for molecular studies to unveil pathogenicity and adaptation mechanisms to environmental cues in M. oryzae. Moreover, the ab initio proteome analysis of the AS repertoire proposed a pleiotropic concept of the fungal genome. Collectively, these AS profiles will provide insights into fungal AS transcriptome complexity during host-pathogen interaction.