Ecological and molecular biological responses of Aristolochia contorta to herbivory stress

Abstract

Aristolochia contorta (Aristolochiaceae) is herbal vine species, which has the distinctive secondary metabolites of family Aristolochiaceae and the specialist herbivore Sericinus montela (swallowtail butterfly). To enhance the sustainability of co-existence of A. contorta and S. montela, interaction between the two species should be studied. To assess the response of A. contorta to the herbivory, I studied the ecological and molecular-biological aspects of A. contorta under the herbivory stress. First, I assessed genetic diversity of A. contorta populations to understand the long-term sustainability of A. contorta population. Genomic DNA samples of A. contorta leaf were used for analysis from four populations (CJ, GP, PT, and YJ) where the vigorous growth was observed in the South Korea. Intra-population genetic diversity and inter-population genetic distance were assessed using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Overall intra-population genetic diversity was lower, compared to the other riparian plant species (h: 0.0607 ~ 0.1401; I: 0.0819 ~ 0.1759). Despite of the geographical distance, population GP showed the larger genetic distance from other populations. This result seemed to be caused by the fragmented habitat and lower sexual reproduction of A. controta. Secondly, I performed the mesocosm experiment to assess the phenotypic plasticity of A. contorta under the herbivory stress. Physical damage on the young leaf or mature leaf was applied to one-year-old A. contorta seedlings under two light availability conditions (daylight and shade condition). Light availability significantly affected the most of the morphological characteristics. Leaf damage seemed to induce the emergence of branch and new leaf. Biomass production also increased under leaf damage treatment. Compensatory growth effect of leaf, shoot, and biomass production seemed to be stronger when young leaves were damaged rather than mature leaves. The higher phenotypic plasticity to leaf damage was observed under the daylight treatment. These results indicate that A. contorta could show the vigorous growth under the moderate leaf damage stress with sufficient light. Subsequently, I tried to assess the transcriptomic response of the A. contorta under herbivory stress by de novo transcriptome assembly. Transcriptome of the A. contorta leaves under control, simple wounding (W+DW), and simulated herbivory with oral secretion of S. montela (W+OS) treatment were compared. In addition, systemic response was also assessed from the upper leaves (systemic leaf). Total 92,323 contigs were filtered, and 28,231 contigs could be annotated under Gene Ontology (GO) database. Over half of the total DEGs (1,875 of 3,177 contigs) differentially expressed only by W+OS treatment. Secondary cell wall seemed to be reinforced under both W+DW and W+OS treatments from the cell wall related terms and lignin biosynthesis pathway. Both W+DW and W+OS treatments seemed to trigger the reactive oxygen species (ROS), ethylene, and jasmonic acid related signaling pathway. Contigs which are predicted to be involved in general herbivory response such as polyphenol oxidase, chitinase, MYB transcription factors, and jasmonate O-methyltransferase were up-regulated under W+OS treatment. Biosynthesis of some secondary metabolites including alkaloids were predicted to be induced by herbivory, which could affect the generalist herbivores rather than the specialist herbivores. However, specific secondary metabolite biosynthesis of Aristolochia such as aristolochic acids seemed to be not induced by herbivory. This results suggest the major defense mechanism against specialist herbivore of basal angiosperms could be similar to the previously studied eudicots. From my study, A. contorta seemed to be able to co-exist with the specialist herbivore S. montela even under the herbivory stress with the compensatory growth and defense mechanism. On the other hand, genetic diversity of A. contorta population was relatively low. To enhance the sustainability of the co-existence of S. montela and A. contorta, proper environmental condition should be provided. Results from this study could contribute to the integrative understanding of plant response to herbivory as well as the conservation of plant-herbivore interaction.

쥐방울덩굴(Aristolochia contorta)은 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae)에 속하는 덩굴성 초본식물로, 쥐방울덩굴과 특유의 이차 대사산물을 생산한다. 또한 쥐방울덩굴은 꼬리명주나비(Sericinus montela)의 유일한 기주식물이다. 쥐방울덩굴과 꼬리명주나비의 상호작용에 관한 이해는 두 종의 공존의 지속가능성을 이해하는 데 있어 반드시 필요하다. 본 연구에서는 초식에 대한 쥐방울덩굴의 반응을 파악하기 위하여 초식 스트레스 조건에서 쥐방울덩굴의 반응에 관한 생태학, 분자생물학적 현상에 관하여 알아보았다. 첫째로, 장기적인 쥐방울덩굴 개체군의 지속 가능성을 파악하기 위하여 개체군의 유전적 다양성을 조사하였다. 쥐방울덩굴 생육이 활발한 것으로 알려진 국내의 네 개체군에서 잎을 채집하여 유전체 DNA를 추출하여 분석에 사용하였다. 개체군 내 유전적 다양성과 개체군간 유전적 다양성은 5개 무작위 프라이머를 이용한 RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) 방법을 사용하여 분석하였다. 수변 경계종임을 고려했을 때, 다른 습지식물들에 비하여 유전적 다양성이 상대적으로 낮은 것으로 나타났다 (h: 0.0607 ~ 0.1401; I: 0.0819 ~ 0.1759). 또한 지리적 거리와 무관하게 개체군 GP는 다른 개체군들로부터 유전적 거리가 큰 것으로 나타났다. 이러한 결과는 쥐방울덩굴의 파편화된 서식지 범위와 낮은 유성생식 비율에 기인한 것으로 보인다. 둘째로, 초식 스트레스에 의한 쥐방울덩굴의 표현형적 가소성을 알아보고자 메조코즘 실험을 수행하였다. 두 가지 빛 가용성 조건(일광 조건 및 그늘 조건) 하에서 생육 중인 일년생 개체의 어린 잎 혹은 성숙 잎을 손상시킨 후 생육 반응을 조사하였다. 상대광도는 대부분의 형태적 특성에 영향을 미쳤다. 잎 손상은 새로운 가지와 잎의 생성을 유도하는 효과를 보였다. 또한 잎 손상이 일어난 개체에서 생물량 또한 높은 것으로 나타났다. 이러한 잎 손상에 따른 보상 생장은 성숙 잎보다 어린 잎을 손상시켰을 때 더 크게 나타났다. 또한 표현형적 가소성의 경우 일광 조건에서 더 큰 것으로 나타났다. 이러한 결과는 적절한 빛이 주어졌을 때 쥐방울덩굴은 적정 수준의 초식 스트레스 하에서도 활발한 생장을 보일 수 있음을 시사한다. 마지막으로 쥐방울덩굴의 전사체의 de novo assembly를 수행하여 초식 스트레스 하에서 유전자 발현 양상 변화를 파악하고자 하였다. 대조군, 단순 잎 손상(W+DW), 손상 부위에 꼬리명주나비 유충 구강 분비물을 처리한 모의 초식(W+OS) 세 처리 조건에서 쥐방울덩굴 잎의 전사체 변화를 비교하였으며, 전신 반응(systemic response) 또한 비교하였다. 총 3,177개 DEG (differentially expressed genes) 중 절반 이상인 1,875개 DEG가 W+OS 처리가 가해진 조건에서만 다르게 발현되는 contig들에 해당하였다. 세포벽 혹은 리그닌 생합성 관련 term들의 발현 양상으로 미루어 보아, 두 처리조건 모두에서 세포벽 보강이 유도됨을 유추할 수 있었다. 또한 두 처리조건에서 모두 활성산소종(reactive oxygen species), 에틸렌, 자스몬산 등과 관련된 신호전달 경로를 활성화시키는 것으로 추정되었다. W+OS 조건에서 일반적인 초식 반응에 관여하는 것으로 알려진 polypenol oxidase, chitinase, MYB transcription factors, jasmonate O-methyltransferase 등의 발현량이 증가하는 것으로 나타났다. 알칼로이드계 물질을 포함한 일부 이차 대사산물들의 합성량이 초식에 의해 유도되는 것으로 보였으나, 아리스톨로크산과 같은 Aristolochia속 특이적인 이차 대사산물 발현과 관련된 유전자 발현은 유도되지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 기저 속씨식물에서 특이적 초식동물에 대한 방어기작은 일반적인 방어기작을 증가시키는 방향으로 유도되는 것으로 유추하였다. 본 연구로부터, 쥐방울덩굴은 특이적 초식동물인 꼬리명주나비의 초식에 대한 보상 생장과 방어 기작을 통해 공존할 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 연구 결과는 식물-곤충 상호작용 관점에서의 보전과 관련된 기초적인 자료를 제공함과 더불어 초식에 대한 식물의 반응에 대한 다각적 이해에 기여할 수 있을 것이다.