Development of a fluorescent sensor Quenchbody for rapid analysis of procollagen type III N-terminal peptide

Abstract

Procollagen type III N-terminal peptide (PIIINP) is a major biomarker of growth hormone which is on the prohibited substances list by the World Anti-Doping Agency (WADA). The recently developed and conducted PIIINP analysis methods are radio immunoassay (RIA) or fluorescence-based sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and these have issues with radiation safety, time-consuming, and expensive equipment. Therefore, the development of an analysis method that can overcome these shortcomings is required. To this end, we tried to develop a high-throughput doping analysis method using a fluorescence-based antibody sensor called Quenchbody. The quenchbody consists of a single chain variable fragment (scFv) and a fluorophore which emits fluorescence depending on the presence or absence of an antigen The sequence of anti-PIIINP scFv was obtained from a hybridoma cell and cloned scFv was expressed in E. coli. Inclusion body refolding was performed to obtain more scFv, and fluorescence was conjugated to native and refolded anti-PIIINP scFv that were confirmed to have antigen binding affinity against PIIINP. Finally, dose-dependent fluorescence signal were confirmed with a fluorescence spectrophotometer. The best limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were calculated as 1.64 nM and 3.89 nM for TAMRA-labeled quenchbody with native anti-PIIINP scFv, according to the five-point logistic curve regression. Furthermore, with 2 nM of quenchbody, the analysis could be performed within 30 minutes from the experimental preparations to validations. Thus, we confirmed the high-throughput and high sensitivity capabilities of quenchbody required for a new doping analysis method.

프로콜라겐 III형 N-말단 펩타이드는 성장 호르몬의 주요한 바이오 마커로서 성장호르몬은 세계반도핑기구의 금지약물목록에 올라와 있다. 이에 따라, 근래에 개발된 방사면역측정법이나 형광기반의 샌드위치 효소결합 면역흡착검사와 같은 방법으로 프로콜라겐 III N-말단 펩타이드를 검출하고 있으나, 이들 방법은 방사능 안전성, 긴 분석 소요 시간, 값비싼 장비의 사용과 같은 문제가 있다. 그러므로 기존 분석법의 문제를 해결할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구되고 있는 상황이다. 따라서 본 연구에서는 형광기반의 항체 센서인 퀜치바디를 만들어 고속 도핑 분석법을 개발하고자 하였다. 퀜치바디는 단일 쇄 가변 단편 형태로 만들어진 항체와, 항원의 유무에 따라 형광을 방출하는 형광 분자로 이루어진다. 항프로콜라겐 III형 N-말단 펩다이드의 단일 쇄 가변 단편의 서열은 하이브리도마 세포로부터 얻어졌으며 재조합된 단백질은 대장균에서 발현되었다. 많은 양의 단일 쇄 가변 단편을 얻기 위해 봉입체 재접힘이 시도되었으며, 항원 결합성이 확인된 천연 및 재접힘 단일 쇄 가변 단편에 형광을 부착하였다. 마지막으로 형광광도계를 이용하여 퀜치바디의 항원 농도에 따른 형광 세기의 증가를 확인하였다. 그 결과로 5개 변수 로시스틱 곡선 회귀 분석에 따라 TAMRA-라벨된 천연 단일 쇄 가변 단편을 사용한 퀜치바디가 각각 1.64 nM과 3.89 nM의 검출한계와 정량한계를 가져 가장 우수한 것으로 나타났다. 또한, 이는 2 nM의 퀜치바디를 이용해 실험 준비부터 결과 검증까지 30분 이내에 분석을 진행할 수 있었다. 따라서 우리는 새로운 도핑 분석법에 필요한 신속성과 고감도성을 퀜치바디에서 확인할 수 있었다.