Glucose deficiency-induced changes in tumor tissues: Phenotypic and molecular aspects

Abstract

종양 미세 환경에서 종양 세포의 호기성 해당작용 및 신생 혈관 형성증은 포도당 결핍 환경을 유도한다. 종양 조직 내 종양 섬유아 세포 및 면역세포는 정상 조직 내 동일 세포와 대사 표현형이 다르며, 종양세포와 상호작용을 통해 종양 악성도를 향상시킨다. 그러나, 포도당 결핍 환경이 종양세포, 종양 섬유아 세포 및 종양 면역세포에 미치는 역할은 거의 연구가 되어있지 않다. 본 연구는 포도당 결핍에 의해 변화된 종양세포, 종양 섬유아 세포 및 종양 면역세포의 대사 작용이 종양 악성도에 미치는 역할에 대해 연구하였다. 포도당 결핍 환경에 적응한 악성 중피종 세포에 Metformin을 처치 시 약물 저항성 관련 인자인 multidrug resistance protein 1 (MDR1)의 발현이 세포막, 핵보다 미토콘드리아에서 증가하였다. 또한, 미토콘드리아의 기능 및 형태적 변형이 관찰되었다. 특히, 심각한 mitochondrial membrane potential (MMP) 과분극이 관찰되었다. 하지만, MMP탈분극 유도제인 Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone 처치 시, 미토콘드리아 내 MDR1 발현이 감소되었으며, metformin 저항성이 감소하였다. 포도당 결핍 환경에서 생존한 MDR1의 유전자적 발현이 제거된 중피종 세포는 정상 세포와 비교하여 metformin 저항성이 유의적으로 감소하였다. 본 연구는 포도당 결핍에 적응한 악성 중피종 세포의 미토콘드리아 대사 변형에 의해 증가되는 MDR1이 metformin 저항성을 유도함을 확인하였다. 정상 섬유아 세포와 달리 종양 섬유아 세포는 종양 세포의 이동능, 증식, 전이능 등을 향상시켜 악성도를 증가시킨다. 또한, 종양 조직의 비 정상적인 신생혈관 형성증은 동일한 종양 조직 내에서 이질적인 반응을 유도한다. 하지만, 포도당 결핍 환경에서 정상 섬유아 세포와 차별적인 종양 섬유아 세포의 이질적인 표현형 및 대사적 특징에 관한 연구는 수행되지 않았다. 본 연구에서 동일한 종양 조직을 6개로 절제한 후 각 각의 종양 조직에서 섬유아 세포를 분리 배양한 뒤, 포도당 결핍 환경에서 배양하였다. 그리고 정상 섬유아 세포는 동일 연령의 마우스의 피부 및 폐 조직에서 분리 배양하였다. 포도당 결핍 환경에서 종양 섬유아 세포는 정상 섬유아 세포와 달리, 세포 증식 및 에너지 합성이 증가되었으며, 각 조직 유래 종양 섬유아 세포에서 동일한 패턴이 관찰되었다. 하지만, 정도는 이질적이였다. 정상 섬유아 세포와 비교하여, transforming growth factor-β (TGF-β) signaling와 mitochondrial calcium uniporter (MCU)의 발현은 종양 섬유아 세포에서 증가되며, 포도당 결핍 환경에서 더욱 향상된다. 하지만 TGF-β signaling을 억제할 경우, 세포 증식, 에너지 합성 및 미토콘드리아 내 칼슘양이 유의적으로 감소되었다. 또한, 종양 섬유아 세포에서TGF-β signaling억제는 MCU의 발현을 감소시켜 미토콘드리아 내 칼슘 함량을 감소시켰다. 하지만 정상 섬유아 세포에서는 큰 차이를 보이지 않았다. 포도당 결핍 환경에서 증가된 칼슘은 미토콘드리아 내 ATP 합성을 촉진시켜 종양 섬유아 세포의 증식을 향상시켰다. 하지만, 미토콘드리아 내 ATP 합성 효소를 억제할 경우, 칼슘은 배출되지 못해 계속 축적되며, 이는 심각한 세포 사멸을 유도하였다. 종양 섬유아 세포는 직접적 또는 매개인자를 통한 간접적으로 종양 세포의 악성도를 향상시킨다. 정상 섬유아 세포와 비교하여 종양 섬유아 세포에서 증가된 stearoyl-CoA desaturase (SCD) 발현은 oleic acid (OA) 합성을 증가시킴을 확인하였다. 또한, 종양 섬유아 세포 유래 OA는 세포 외로 배출되어 지방 수송 통로를 통해 폐암 세포로 이동되어 포도당 결핍 환경에서 자가 포식 작용에 의해 분해되어 지방 대사를 활성화시킨다. 이 결과, 폐암 세포 내 증가된 SCD발현은 β-oxidation과 액틴 중합체를 향상시켜 yes-associated protein 를 핵 내로 이동시켜 폐암 줄기 세포 형성을 촉진한다. 그리고, SCD 과발현 폐암 세포를 면역 결핍 마우스에 접종 시 종양의 크기는 정상 및 SCD knock out세포 접종 군과 비교하여 유의적으로 증가된다. 그리고 비소세포폐암 환자의 조직에서 SCD 염색 결과, 폐암의 진행 및 등급이 높을수록 발현이 증가됨을 확인하였다. 종양 섬유아 세포 유래 OA은 종양 세포뿐만 아니라 CD4+ 종양 침윤 림프구로도 이동하여 SCD의 발현을 증가시킨다. 포도당 결핍 환경에서 SCD의 발현은 더욱 증가되며 Th1 세포 표현형 마커인 T-bet, interleukin-2, interferon-γ의 발현을 증가시킨다. 하지만, SCD 억제제를 처치할 경우, 포화 지방산인 palmitic acid의 함량이 증가되어 mitochondrial superoxide를 합성하여 regulatory T cell 표현형 마커인 Foxp3, TGF-β, CD25의 발현이 증가된다. 그리고 SCD의 발현이 증가된 CD4+ T cell는 CXCL11를 과량 분비하며, 이는 CD8+ T cell의 C-X-C chemokine receptor type 3 (CXCR3)와 결합하여 암세포 사멸 효과를 유의적으로 향상시킨다. 실제로 마우스 종양 모델에서 CXCR3-CD8+ T cell의 접종은 뛰어난 종양 억제 효과를 보였다. 본 연구들의 결과는 포도당 결핍에 의해 종양 세포, 종양 섬유아 세포와 종양 면역세포의 변화된 대사 표현형이 단독 또는 세포들 간의 상호관계에 미치는 분자생물학적 기전을 연구하였다. 이러한 결과는, 적대적 종양 미세환경인 포도당 결핍이 종양 세포, 비 종양 세포에 미치는 대사 및 분자생물학적 기전 이해에 지대한 역할을 할 수 있다고 사료된다. 또한, 포도당 결핍에 의해 조절되는 종양 악성도를 향상시키는 주요 인자를 대상으로 한 연구는 항암 치료를 향상시킬 수 있다.

Within a hostile tumor microenvironment, irregular vasculature and aerobic glycolysis induce a glucose deficiency. Tumor mass is constituted with cancerous and non-cancerous cells such as cancer-associated fibroblasts (CAFs) and tumor-infiltrating lymphocytes (TILs). Compared to normal counterparts, those cells are acquired different phenotypes and metabolism, and their crosstalk enforces the tumor progression. However, the comprehensive impact of glucose deficiency in cancer cells, CAFs and TILs have not been elucidated. In this study, we investigated that glucose deficiency renders metabolic reprogramming in cancer cells, CAFs and TILs compared to complete condition and promote tumor progression. The effect of glucose deficiency on phenotype of human malignant mesothelioma (HMM) cells remains unclear. Our data demonstrated that survived HMM cells by glucose deficiency enhanced the resistance to metformin treatment with upregulation of multidrug resistance protein 1 (MDR1) expression in mitochondria. Adapted HMM cells to glucose deficiency showed an irregular mitochondrial metabolic status with elongated morphology and dysfunction including mitochondrial membrane potential (MMP) hyperpolarization. Intriguingly, increased MDR1 expression in the cells was suppressed by treatment of carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP), an inducer for MMP depolarization. In MDR1-knockout (KO) cells, sensitivity to metformin was dramatically augmented compared to parental cells with upregulation of apoptosis and autophagy. CAFs are major components in non-cancerous stromal cells in tumor microenvironment and protecting cancer cells. However, compared to normal fibroblasts (NFs), distinctive characteristics of CAFs under glucose-deficient conditions are rarely studied. Irregular vasculature induces the heterogeneous response in tumor mass. To determine the heterogeneous response in CAFs, we dissected a tumor mass as 6 pieces and isolated CAFs from each piece. The ATP production and proliferation were enhanced in CAFs under glucose-deficient condition, but not in NFs. Moreover, their patterns were consistent in whole CAFs, but the degree was heterogeneous. In contrast to NFs, transforming growth factor-β (TGF-β) signaling and mitochondrial calcium uniporter (MCU) expression was higher in CAFs and more enhanced under glucose-deficient condition, but these phenotypes were suppressed by inhibition of TGF-β signaling. Intriguingly, treatment of Ru360, a selective MCU inhibitor also mitigated the TGF-β signaling in CAFs. The influx of calcium into mitochondria enhanced the ATP production in CAFs by activation of ATP synthase. However, treatment of ATP synthase inhibitor enhanced the apoptosis by excessive calcium influx into mitochondria via inactivation of mitochondrial permeability transition pore. CAFs reinforces the cancer cell malignancy via direct- and soluble-factor mediated communication. Here, we demonstrated that CAFs-derived lipids especially oleic acid (OA) were transition into H460 cells via lipid transporter and enhanced stearoyl-CoA desaturase (SCD) expression under glucose-deficient conditions. Expression of SCD augmented autophagic response in CAF-supernatant treated H460 cells under glucose-deficient condition and promoted stemness, but their phenotypes were suppressed by treatment of CAY10566, a selective SCD inhibitor. SCD-overexpressing cells exhibited enhancement of stemness with nuclear localization of YAP through actin-polymerization compared to parental and SCD-KO cells. Furthermore, a larger size of tumor was observed in SCD-overexpressing cells injected mice than parental cells, whereas SCD-KO cells resulted in smaller tumors. Additionally, SCD was correlated with poor prognosis in patients with lung adenocarcinoma. CAFs-derived OA was also transferred in CD4+ tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) and augmented SCD expression under glucose-deficient condition. In CD4+ TILs, SCD enhanced the phenotype of Th1 cell including IL-2, tumor necrosis factor-α, T-bet and interferon-γ expression, whereas regulatory T cell (Treg) phenotype including CD25, Foxp3 and TGF-β were suppressed. However, it was reversed by treatment of CAY10566. SCD biosynthesized unsaturated fatty acid from saturated fatty acids. Amounts of OA, unsaturated fatty acids, was increased in SCD overexpressed T cells and upregulated the phenotype of Th1 cell. However, enrichment of palmitic acid (PA) among saturated fatty acids in SCD-KO cells enhanced Treg cell phenotype. Moreover, a robust secretion of C-X-C motif chemokine 11 (CXCL11) from SCD-upregulated CD4+ T cells activated CXC-chemokine receptor 3 (CXCR3) signaling in CD8+ T cells, improving cancer-killing effect in 4T1 mouse model. Collectively, the present study demonstrated that glucose deficiency is impacted on the cancer cell malignancy and induces metabolic reprogramming in CAFs and TIL. For a better understanding of the effects of glucose deficiency, our data provide a detailed mechanism and phenotypes in cancer cells, CAFs and TIL. These features aimed approach could enhance anticancer therapeutics.