High-throughput sequencing based analysis of bacterial diversity as well as blaCTX-M gene variants from river and hospital wastewater

Abstract

The aquatic environment of river water is the most intensively human influenced ecosystem in the world as it receives huge amount of urban, hospital, animal and industrial effluents and create a reservoir of diverse type of bacteria. This contaminated ecosystem provides optimum conditions to antibiotic resistant bacteria from various sources to mix and transfer their resistant gene(s) to clinically important bacteria for development of human pathogens with novel resistance mechanisms. Hospital wastewater, in particular, is expected to contain high abundances of antibiotic resistance genes (ARGs) as it contains human enteric bacteria that may include antibiotic-resistant organisms originating from hospital patients, and can also have high concentrations of antibiotics and antimicrobials that facilitate the environmental spread of antibiotic resistance. Therefore, in this study, we applied 16S rRNA gene sequencing, a culture-independent method to analyze bacterial diversity present in river as well as hospital wastewater. River and hospital wastewater were collected from Dhaka, Bangladesh and sequenced for V3 and V4 region of 16S rRNA gene resulting in a total of 36 sequence libraries. In total 4,13,297 sequence reads were obtained where the number of sequence reads ranged from 1333 to 38110 reads per library. The taxonomic analysis revealed 8 phyla, 12 classes, 13 orders, 22 families and 102 genera present in the river and hospital wastewater samples. Additionally, permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA) of bacterial membership in terms of Bray-Curtis, based on operational taxonomic unit (OTUs) at a 97% sequence similarity threshold showed significant bacterial diversity between river and hospital wastewater. Moreover, compositions and relative abundance of the bacterial genera showed the presence of most pathogenic bacteria, mostly in the hospital wastewater. We performed another study to analyze blaCTX-M variants for their extensively emerging clinical importance. The presence of blaCTX-Mgene in the bacteria producing extended spectrum beta lactamases (ESBLs) has made it resistant to the broad-spectrum third-generation cephalosporin antibiotics that are used in hospitals to treat infections of the skin and respiratory tract caused by both Gram negative and Gram positive bacteria. The river and hospital wastewater were sequenced for ARG, resulting in a total of 33 sequence libraries. Out of 172 variants of blaCTX-M reported so far, our study found 124 variants, around 62% of which are present in hospital wastewater. The non-metric multidimensional scaling (NMDS) showed that there is close association among the blaCTX-M variants present in hospital wastewater whereas the variants for river water is scattered through the sampling sites. Overall, the findings of our study indicated that river and hospital wastewater contains diverse types of bacteria where the bacterial community from river water significantly differs from that of hospital wastewater. Both of the sampling site contains multidrug resistant bacterial genera that may pose serious threat to the aquatic environment of river water resulting in a serious public health burden. Moreover, the presence of significant number of blaCTX-M variants may facilitate the global burden of antimicrobial resistance.

강물의 수생 환경은 인간에게 가장 집중적인 영향을 받는 생태계이다. 인간 사회에서 배출되는 가정, 병원, 축산 및 공장 폐수 등은 강으로 유입되어 강물 속에 다양한 박테리아가 존재하게 만든다. 이와 같이 오염된 수생 환경은 다양한 항생제 내성 박테리아가 혼합될 수 있는 최적의 조건을 제공하고 항생제 내성 유전자가 전달되어 강력한 병원성 박테리아를 생성할 수 있다. 특히, 병원으로부터 배출된 폐수는 높은 농도의 항생제와 항미생물제를 포함하고 있으며 항생제 처방을 받은 환자들의 장내 미생물도 포함하고 있다. 따라서, 본 연구에서는 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용하여 방글라데시 다카의 병원 폐수와 강물에 존재하는 박테리아의 다양성을 분석하였다. 이를 위하여 36 개의 DNA 라이브러리를 제작하였으며 최소 1,333 개에서 최대 38,110 개에 달하는 총 4,13,297 개의 시퀀스를 획득하였다. 이를 활용하여 강물과 병원 폐수에 존재하는 8 개의 문, 12 개의 강, 13 개의 목, 22 개의 과, 102 개의 속으로 분류되는 박테리아의 분류학적 정보를 획득하였다. 그리고 Permutational multivariate analysis of variance 를 통해 강물과 병원 폐수에 존재하는 각각의 박테리아의 구성이 통계적으로 유의한 차이를 보임을 확인하였다. 또한, 병원 폐수에서 병원성을 띄는 박테리아 속의 비율이 강물보다 높은 것을 확인하였다. 추가적으로, 강물과 병원 폐수에서 임상적으로 중요한 blaCTX-M유전자 변이를 분석하였다. 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아에 의해 야기되는 피부와 호흡기의 감염을 치료하기 위해 세팔로스포린 항생제를 사용하는데, blaCTX-M 유전자를 지닌 박테리아는 세팔로스포린에 대한 내성을 띄게 된다.강물과 병원 폐수 내 항생제 내성 유전자를 확인하기 위하여 33 개의 blaCTXM 라이브러리를 제작하였다. 현재까지 보고된 172 개의blaCTXM유전자 변이 중 124 개를 발견하였으며 이 중 62%는 병원 폐수에 존재하는 것을 확인하였다. Non-metric multidimensional scaling 은 병원 폐수에 존재하는 blaCTX-M변이 간에 밀접한 연관이 있는 반면, 강물에 존재하는 blaCTX-M 변이는 샘플링이 이루어진 장소에 따라 변하는 것을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구는 강물과 병원 폐수에 다양한 종류의 박테리아가 존재하고 강물과 병원 폐수 내의 박테리아 집단은 통계적으로 유의하게 다른 것을 보여주었다. 또한, 본 연구에서 확보한 샘플에서 항생제 내성 박테리아 속을 포함하고 있는 것을 확인하였고, 이는 강물의 수생 환경과 공중 보건에 심각한 위협을 줄 수 있음을 의미한다. blaCTX-M의 다양한 변이를 확인하였고, 이는 항생제 내성에 대한 전지구적 부담을 촉진할 수 있음을 의미한다.