Immunomodulatory effect of canine peripheral blood mononuclear cell-derived B lymphocytes pretreated with lipopolysaccharide through macrophage polarization

Abstract

B 림프구의 일종인 조절 B 림프구는 자가면역과 염증상황에서 면역을 억압한다는 연구결과가 있으며, 여기에는 여러가지 메커니즘이 관여하지만 그 중에서도 interleukin(IL)-10을 분비하는 것이 조절 B 림프구의 항염증 능력에 주요한 역할을 하는 것이 알려져 있다. 또한, 이전 연구에 의하면 Lipopolysaccharide(LPS)를 B 림프구에 전처리하였을 때, IL-10 분비가 증가함이 알려져 있다. 따라서 IL 10을 과발현하는 B 림프구를 면역질환에서 세포치료제로 적용하는 것에 대한 연구가 활발히 진행중이지만, 현재 개의 B 림프구에 대한 연구는 많지 않다. 따라서 이 연구의 목적은 LPS로 전처리한 개 말초혈액 단핵세포 유래 B 림프구의 면역조절 유전자 발현 정도를 조사하고, 이를 염증상황의 대식세포와 공배양한 후 항염증 M2 대식세포로 유도되는지 확인하여, LPS로 전처리한 B 림프구의 항염증 및 면역조절 능력을 평가하는 것이었다. 개의 B 림프구는 3마리의 건강한 참여견의 말초혈액 단핵세포로부터 얻었다. 먼저, B 림프구에 대한 LPS의 세포독성을 확인하기 위해 B 림프구에 LPS를 5 ng/mL, 10 ng/mL 농도로 전처리한 후 CCK-8 실험을 실시하였다. 그리고 LPS로 전처리한 B 림프구에서 유세포 분석을 통해 조절 B 림프구의 마커인 IL-10의 발현에 대해 조사하였으며, 면역조절 능력을 알아보기 위해 실시간 qPCR(RT-qPCR)을 통해 IL-10, programmed death-ligand 1(PD-L1), transforming growth factor beta(TGF-β)와 같은 면역조절 유전자의 발현에 대해 조사하였다. 다음으로 염증상황에서 LPS로 전처리한 B 림프구의 대식세포에 대한 면역조절 효과를 평가하기 위해 대식세포주(RAW 264.7 cell line과 DH82 cell line)와 전처리한 B 림프구를 공배양하였다. 대식세포에 염증상황을 유도하기 위해 LPS로 자극하였고, 공배양한 대식세포에서 RNA를 추출하여 면역반응 양상과 염증성 M1 대식세포 및 항염증성 M2 대식세포의 마커에 대해 확인하였으며, 단백질 수준에서 M2 대식세포로의 분극화를 확인하기 위해 M2 대식세포 표지 단백질인 CD206을 이용하여 면역형광검사법을 실시하였다. 세포독성시험에서 대조군과 LPS 전처리군에서 세포생존율에 유의미한 차이가 없어, LPS 전처리가 B 림프구에 독성이 없음을 확인하였다. 그리고 조절 B 림프구의 마커인 IL-10의 발현이 대조군에 비해 LPS 5 ng/mL 전처리군에서 2.32배, LPS 10 ng/mL 전처리군에서 2.64배 증가됨을 확인하였다. 면역조절 유전자 발현은 LPS 5 ng/mL 전처리군에서는 대조군에 비해 IL-10의 유전자 발현만이 3.07배로 유의미하게 증가하였으며(P < 0.05), LPS 10 ng/mL 전처리군에서는 대조군에 비해 IL-10은 8.75배(P < 0.001), PD-L1은 2.46배(P < 0.05), TGF-β는 2.47배(P < 0.05) 유의미하게 증가하였다. 이와 같이, LPS 전처리에 의한 IL-10 마커 과발현 효과와 면역조절 유전자 발현 유도효과가 LPS 10 ng/mL 전처리군에서 더 크게 나타나, 이후 실험에는 LPS 10 ng/mL 전처리군만을 이용하였다. LPS로 전처리한 B 림프구와 공배양한 대식세포의 면역반응 양상은 LPS로 자극한 대식세포군과 비교하였을 때, 각각 RAW 264.7 cell line에서는 전염증성 사이토카인인 TNF-α가 0.04배 유의미하게 감소하고 항염증성 사이토카인인 IL-10이 8.21배 유의미하게 증가하였고, DH82 cell line에서는 TNF-α가 0.26배 유의미하게 감소하고 IL-10이 12.39배 유의미하게 증가하였다(P < 0.001). 또한 염증성 M1 대식세포 마커인 iNOS와 항염증성 M2 대식세포 마커인 CD206 유전자 발현 변화양상은, LPS로 자극한 염증상황의 대식세포와 비교하였을 때, 각각 RAW 264.7 cell line에서는 iNOS가 0.03배 유의미하게 감소하고(P < 0.01) CD206가 7.97배 유의미하게 증가하였고(P < 0.001), DH82 cell line에서는 iNOS가 0.11배 유의미하게 감소하고(P < 0.01) CD206가 8.72배 유의미하게 증가하였다(P < 0.05). 단백질 수준에서는, LPS 처리군에 비해서 LPS로 전처리한 B 림프구와 공배양하였을 때, CD206을 발현하는 세포가 RAW 264.7 cell line에서 6.5배, DH82 cell line에서 14.15배로 유의미하게 증가하였다(P < 0.001). 이 연구를 통하여 개 말초혈액 단핵세포로부터 유래한 B 림프구를 LPS로 전처리할 경우, 면역조절 능력이 증대된 IL-10 과발현 B 림프구를 생성할 수 있음을 확인하였고, 염증상태의 대식세포가 M2 대식세포로 분극화 유도됨을 확인함으로써, LPS로 전처리한 개 B 림프구의 면역조절 효과 및 항염증 효과를 입증하였다. 이러한 결과를 통하여 수의임상에서 LPS로 전처리한 개 B 림프구의 개의 면역관련질환에 대한 선구적인 세포 치료제로서의 가능성을 확인하였다.

Regulatory B cells (Bregs), the specific subset of B cells, downregulate inflammation and autoimmunity. It has been studied secreting interleukin (IL)-10 is the key contributor of Bregs and preconditioning B cells with lipopolysaccharide (LPS) increases IL-10 protein production and secretion. Therefore, various studies are conducted with the goal of applying IL-10 overexpressing B cells as therapeutic agents to patients with immune-related inflammatory diseases, but there are only a few studies on canine B cells. This study aimed to investigate the immune regulatory gene expression of canine peripheral blood mononuclear cell (PBMC)-derived B cells pretreated with LPS, and evaluate the anti-inflammatory and immunomodulatory capacity of primed B cell by identifying anti-inflammatory macrophage M2 polarization when cocultured with primed B cells. Canine B cells were isolated from canine PBMCs, which were obtained from three healthy canine donors. The B cells were treated with 5 ng/mL, 10 ng/mL of LPS to evaluate the cytotoxicity of LPS on B cells by CCK-8 assay. Then expression marker of Bregs such as IL-10 was investigated by flow cytometry, and determined the immunomodulatory capacity of primed B cells, by investigating the gene expression of immunoregulatory factors such as IL-10, programmed death-ligand 1 (PD-L1), and transforming growth factor beta (TGF-β) using real-time quantitative PCR (RT-qPCR). Moreover, LPS pretreated macrophage cell lines (RAW 264.7 and DH82 cell line) were co-cultured with primed B cells to assess immunomodulatory effect of primed B cell on macrophages in inflammatory condition. Macrophages were pretreated with LPS to induce inflammatory condition. After RNA extraction from macrophages, it was investigated for immune condition, and M1, M2 macrophage markers, and to investigate M2 polarization in protein level, immunofluorescence analysis was performed, using CD206 as M2 marker protein. From cell viability assay, confirmed that LPS have no cytotoxicity on B cells. Bregs expression marker IL-10 was increased significantly by 2.32-fold in LPS 5 ng/mL group and increased significantly by 2.64-fold in LPS 10 ng/mL group, in comparison with control group. The gene expression of immunoregulatory factors in LPS 5 ng/mL group, only IL-10 showed 3.07-fold significant increase (P < 0.05) compared to control group and in LPS 10 ng/mL group, IL-10, PD-L1, and TGF-β, respectively, showed 8.75-fold (P < 0.001), 2.46-fold (P < 0.05), 2.47-fold (P < 0.05) significant increase compared to control group. Since the effect of LPS treatment was higher in LPS 10 ng/mL group, it was chosen for further experiment. The immune condition of macrophages when co-cultured with primed B cells compared to the LPS-treated group, in RAW 264.7 cell line, showed 0.04-fold decrease in proinflammatory cytokine TNF-α and 8.21-fold increase in anti inflammatory cytokine IL-10 and in DH82 cell line, showed 0.26-fold decrease in TNF-α and 12.39-fold increase IL-10, respectively (P < 0.001). Additionally, the changes in M1 macrophage marker iNOS and M2 macrophage marker CD206 compared to the LPS-treated group, in RAW 264.7 cell line, showed 0.03-fold decrease in iNOS (P < 0.01) and 7.97-fold increase in CD206 (P < 0.001) and in DH82 cell line, showed 0.11-fold decrease in iNOS (P < 0.01) and 8.72-fold increase in CD206 (P < 0.05), respectively. In protein level, macrophages expressing CD 206 were increased 6.5-fold in RAW 264.7 cell line and 14.16-fold in DH82 cell line in comparison with LPS-stimulated macrophages, respectively (P < 0.001). This study revealed that pretreatment of LPS on canine PBMC-derived B cells induced IL-10 overexpressing B cells, and that LPS-primed canine B cells have an anti-inflammatory and immune modulation effect by polarizing macrophages to M2 phenotype, suggesting the possibility of using LPS-primed B cells as a therapeutic agent for its capacity in canine immune related inflammatory diseases.