Impact of imatinib administration on mouse ovarian follicle counts and intra-ovarian protein levels related to follicular quality

Abstract

Following the development of cancer management, cancer survivors have increased, and their concerns for future fertility have grown. Compared to the harmful effects of conventional chemotherapeutics on reproduction, new chemotherapeutics show inconclusive evidence about its deleterious effects on reproduction. Women treated with cyclophosphamide (Cp) are at a high risk of premature ovarian failure. One of the mechanisms of Cp-induced ovarian damage is the apoptotic pathway in ovarian follicles. However, few studies have been reported the exact effect of imatinib, a tyrosine kinase inhibitor, on ovarian function. Thus, this study aimed to investigate the impact of imatinib on the quantity and quality of mice ovarian follicles. We injected saline, cyclophosphamide (Cp, 50 or 75 mg/kg), or imatinib (7.5 or 15 mg/kg) into female B6D2F1 mice (eighteen mice for each group). One week later, ovaries were collected. Nine mice in each group were used for follicle count. In multiple ovarian sections stained by Mayers hematoxylin-eosin solution, we counted the number of various types of follicles and the proportion of good quality follicles, which was defined as intact spherical shape of follicles with oocytes. The other nine mice in each group were used for the western blot analysis. Levels of six proteins related to follicular function, apoptosis, and vascularization (AMH, BCL-xL, BAX, A-SMase, caspase-3, and α-SMA) were quantified within whole ovaries. We compared the ovarian follicle counts and expression of proteins among the groups. A significant decrease in primordial follicle count was observed in the group administered imatinib 7.5 mg/kg (p = 0.001) and 15 mg/kg (p = 0.010), as well as in the group administered Cp 75 mg/kg (p = 0.002), compared to the saline control group. In contrast, no differences in primary and antral follicle counts were observed between the group treated with imatinib 7.5 mg/kg or 15 mg/kg and the saline control group. Although administration of Cp 50 mg/kg or 75 mg/kg significantly decreased the proportion of good quality primordial follicles, administration of imatinib 7.5 mg/kg or 15 mg/kg did not reduce the proportion of good quality primordial follicles. AMH level was similar in the groups treated with imatinib 15 mg/kg and Cp 50 or 75 mg/kg, compared to the saline control group. Anti-apoptotic BCLX-L and pro-apoptotic BAX and A-SMase levels were also similar in the five groups. However, Caspase 3 and α-SMA levels were significantly higher in the imatinib 7.5 or 15 mg/kg and Cp 50 or 75 mg/kg groups than those in the saline control group. In conclusion, the administration of imatinib to mice significantly reduced primordial follicle count and increased protein levels of Caspase 3 and α-SMA. Our findings suggest that imatinib has potential ovarian toxicity via apoptotic process, as like in Cp.

암 치료의 발전으로 인해 암 생존자가 증가하고 있고, 그들의 생식 능력 보존에 대한 갈망 또한 증가하고 있다. 기존의 고식적인 항암제가 생식 능력에 유해한 영향을 주는 것으로 잘 알려져 있는 반면에, 새로운 항암제들의 생식 능력에 대한 영향은 연구가 부족한 실정이다. 항암제 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide) 를 투여한 여성의 경우 조기 난소 기능 부전의 위험도가 크게 증가한다. 그 기전의 하나로 사이클로포스파미드로 인한 난포의 세포자멸사 기전이 (apoptotic pathway) 많이 연구되어 왔다. 하지만, 티로신 키나제 억제제 (tyrosine kinase inhibitor) 계열 항암제인 이마티닙 (imatinib) 의 난소 기능에 대한 연구는 현재까지 매우 부족하다. 따라서, 본 연구는 이마티닙 투여가 생쥐 난포의 양과 질에 미치는 영향을 탐색하고자 하였다. 암컷 B6D2F1 생쥐에 식염수, 사이클로포스파미드 (Cp, 50 or 75 mg/kg), 이마티닙 (7.5 or 15 mg/kg)을 각각 주입하였다. 각 그룹에 대해 18마리의 생쥐가 배정되었고 주입 후 1주일 뒤에 난소들이 채취되었다. 각 그룹의 9마리 생쥐에서 얻는 난소를 여러 층으로 자르고 헤마톡실린과 에오신 염색 (hematoxylin-eosin solution) 후, 다양한 종류의 난포 수와 양질의 난포 비율을 확인하였다. 양질의 난포는 온전한 구형으로 난자를 갖고 있는 난포로 정의되었다. 각 그룹의 다른 9마리 생쥐에서 얻은 난소에서 난포의 기능, 세포자멸사, 혈관 기전과 관련있는 6 종류의 단백질 (AMH, BCL-xL, BAX, A-SMase, caspase-3, and α-SMA)이 웨스턴 블랏 (western blot) 분석을 통해 정량화 되었다. 그룹들 사이에서 난포의 수와 발현되는 단백질이 비교되었다. 대조군과 비교시 이마티닙 그룹 (7.5 mg/kg , 15 mg/kg)에서 원시난포의 수가 유의하게 적었고 사이클로포스파미드 75 mg/kg 그룹에서도 유의하게 원시 난포의 수가 적었다. 다른 종류의 난포를 살펴보면, 이마티닙 그룹과 대조군간 일차난포 (primary follicle) 와 동난포 (antral follicle)의 수는 차이가 없었다. 대조군과 비교했을 때 사이클로포스파미드 그룹에서 양질의 원시난포 비율이 유의하게 감소하였는데, 이마티닙 그룹에서는 양질의 원시난포 비율이 감소하지 않았다. 실험군을 대조군과 비교시 AMH, 항세포자멸사 (anti-apoptotic) BCLX-L, 향세포자멸사 (pro-apoptotic) BAX와 A-SMase 단백질 양은 비슷했다. 그러나, 이마티닙 그룹과 사이클로포스파미드 그룹에서 카스파제 3와 α-SMA 단백질은 대조군과 비교시 유의하게 증가하였다. 결론적으로, 생쥐에게 이마티닙을 투약하면 원시난포의 수가 유의하게 줄고 난소에서 카스파제 3와 α-SMA 단백질이 유의하게 늘었다. 이마티닙은 사이클로포스파미드처럼 세포자멸사 기전과 혈관 손상을 통한 잠재적인 난소 독성을 갖는 것으로 보인다.