Inhibitory effect of short-chain fatty acids on growth and biofilm formation of oral streptococci

Abstract

1. 목적

구강 연쇄상구균은 그람양성세균으로 높은 부착능력과 생물막 형성 능력으로 구강 내 질환인 충치, 치주 질환 병소에서 주로 발견되는 박테리아이다. 구강 연쇄상구균는 호기, 혐기 환경 모두에서 생존하며 생물막 형성이 가능하다. 그러나, 현재의 구강 연쇄상구균을 비롯한 구강 내 미생물의 제어 방법은 치아의 강도 감소, 미각의 변화 등의 부작용을 내재하고 있어 차세대 미생물 제어 방법이 필요하다. 단쇄지방산은 미생물의 발효작용으로 생성되는 대사산물로 최근의 연구에서는 장내 병원균의 성장을 억제하고 면역반응 조절을 조절할 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 그러나, 단쇄지방산인 acetate, propionate, 혹은 butyrate가 구강 연쇄상구균에 대한 영향은 알려져 있지 않다. 이에 본 연구에서는 다양한 환경에서 구강 연쇄상구균이 성장할 때와 생물막형성에 대한 단쇄지방산의 영향을 알아보았다.

2. 방법

단쇄지방산이 구강 연쇄상구균 중 Streptococcus gordonii의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 여러 농도의 acetate, propionate, 혹은 butyrate를 처리한 후 정적 호기성 환경에서 성장시킨 후 분광광도계로 흡광도를 측정하였다. S. gordonii가 다양한 환경에서 성장할 때의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 혐기와 호기 그리고 동적 또는 정적 상태에서 단쇄지방산을 처리 한 후 흡광도를 측정하였다. 또한, S. gordonii 임상 분리 균에 대한 단쇄지방산의 영향을 알아보기 위해 단쇄지방산을 처리 후 다양한 성장환경에서 성장시킨 후 흡광도를 측정하였다. 다른 구강 연쇄상구균들의 다양한 성장환경에서 단쇄지방산에 대해 어떠한 영향을 받는지 알아보기 위해 Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, Streptococcus sobrinus, 와 Streptococcus mutans를 혐기와 호기 그리고 동적 또는 정적 상태에서 단쇄지방산을 처리한 후 성장시킨 후 흡광도를 측정하였다. 단쇄지방산이 정균적 혹은 살균적 작용을 하는지 보기 위해 S. gordonii에서 minimum inhibitory concentration (MIC)/minimum bacteriacidal concentration (MBC) 테스트를 진행하였다. 이에 더해 생물막 형성에 대한 단쇄지방산의 영향을 알아보기 위해 경구 연쇄상구균을 여러 농도의 단쇄지방산과 함께 생물막형성을 진행하였다. 그 중 S. gordonii를 대표로 하여 단쇄지방산이 S. gordonii에 초기 부착, 생물막 형성 혹은 형성된 생물막에 대한 영향을 확인하기 위해 단쇄지방산이 처리된 S. gordonii에 생물막을 각 시간별로 정량 하였고 생물막을 형성한 뒤 단쇄지방산을 처리하여 생물막을 정량 하였다. 단쇄지방산이 S. gordonii의 생물막 형성 저해 기전을 알기 위해, 쿼럼센싱 인자인 AI-2 억제제를 단쇄지방산과 동시 처리하였고, 쿼럼센싱에 관련된 유전자에 대한 실시간 연쇄중합반응을 실시하였다.

3. 결과

단쇄지방산인 acetate, propionate, 혹은 butyrate는 모두 S. gordonii의 성장을 억제하였지만, propionate가 S. gordonii의 성장을 가장 효과적으로 억제하였다. 다양한 성장 환경 중 정적 혐기 상태일때의 억제효과가 가장 컸다. 또한, propionate의 혐기환경에서의 억제효과는 S. gordonii의 임상 분리 균 5종에서도 동일한 효과를 보였다. 다른 구강 연쇄상구균에 대한 propionate의 성장 억제 효과는 구강 연쇄상구균의 성장 환경에 따라 달라 졌다. S. gordonii, S. sanguinis, 와 S. oralis는 혐기 환경에서 가장 크게 성장이 억제되었다. S. salivarius의 경우에는 혐기와 호기 정적 또는 동적 상태 모두 균일한 성장 감소를 보였으며 S. mitis 는 동적 상태일 때 성장이 억제되었다. S. sobrinus와 S. mutans는 호기성 환경에서 성장이 억제되었다. 또한, MIC/MBC 테스트 결과 propionate는 살균적 작용을 하지 않고 정균적 작용을 통해 성장을 억제함을 나타냈다. 단쇄지방산의 의한 경구 연쇄상구균의 생물막 형성에 대한 영향은 다양하게 나타났다. S. gordonii의 생물막 형성의 경우에는 acetate, propionate, butyrate 모두에게서 억제 되었으나 성장에 영향을 주지 않고 생물막을 억제 시키는 것은 acetate였다. Acetate, propionate, butyrate는 S. gordonii의 생물막 형성을 초기단계에서부터 억제하였고, 이미 형성된 생물막에서는 아무런 효과를 끼치지 않았다. 또 한, acetate의 S. gordonii 생물막 억제 기전은 쿼럼센싱 인자인 CSP를 억제하는 것으로 나타났다.

4. 결론

본 연구에서는 단쇄지방산인 acetate, propionate, butyrate가 경구 연쇄상구균인 S. gordonii의 성장을 억제할 수 있음을 보여주었다. 그 중 propionate가 가장 강하게 S. gordonii의 성장을 억제하였다. Propionate는 S. gordonii뿐만 아니라 다른 구강연쇄상구균의 성장을 억제할 수 있고 이러한 억제 효과가 다양한 성장 상태에 따라 달라 질 수 있음을 보여주었다. 또 이러한 특징은 실제 환자에서 분리된 균주에서도 동일하게 나타났다. 구강 연쇄상구균의 생물막 형성에 있어서 단쇄지방산은 다양한 효과를 보였다. S. gordonii 생물막 억제에서는 쿼럼센싱 인자를 억제하였다. 따라서 단쇄지방산은 경구 연쇄상구균에 성장과 생물막형성의 저해제로서 사용될 수 있을 것이라고 예상된다.

Objectives

Oral streptococci are facultative anaerobic and gram-positive bacteria that contribute to oral diseases such as tooth decay and periodontal disease through their adhesion and biofilm-forming ability to the teeth and gum. The currently-available methods to remove bacteria or biofilm often accompany various adverse effects including increased antibiotic resistance, soft tissue damage, reduced tooth strength, and taste alterations implicating the need for an alternative, safe microbial control method. Short-chain fatty acids (SCFAs) such as acetate, propionate, or butyrate are metabolites produced by carbohydrate fermentation of commensal bacteria in the gut, and recent studies have shown that they can inhibit the growth of intestinal pathogens and modulate immune responses. However, the effects of SCFAs on oral streptococci are poorly understood. The purpose of this study was to investigate the effects of SCFAs, acetate, propionate, and butyrate, on biofilm formation and growth of oral streptococci under various conditions mimicking oral environment.

Methods

Streptococcus gordonii was incubated in the presence or absence of various concentrations of SCFAs (acetate, propionate, and butyrate) under aerobic versus anaerobic and static versus shaking culture conditions. The bacterial growth was determined by measuring the optical density at 600 nm. The minimum inhibitory concentration/minimum bactericidal concentration test was performed under various conditions to investigate if propionate had bactericidal or bacteriostatic effects. The inhibitory effect of propionate on other oral streptococci was also investigated. On the other hand, the effect of SCFAs on the biofilm formation of various oral streptococci was examined by culturing in the presence of various concentration of SCFAs under aerobic static condition for 24 h. The biofilm formation was examined by a crystal violet assay. To determine the underlying mechanism of SCFAs on biofilm formation, S. gordonii was incubated with SCFAs in the presence of absence of AI-2 inhibitor which blocks its quorum sensing, and its mRNA expression was determined using real-time PCR.

Results Of the SCFAs tested in this study, propionate most potently inhibited the growth of S. gordonii under anaerobic conditions. Propionate inhibited the growth of S. gordonii with bacteriostatic effect. The growth of five S. gordonii clinical isolates was potently inhibited by propionate under anaerobic conditions. The inhibitory effect of propionate on oral streptococci was dependent on the growth conditions. S. sanguinis and S. oralis were inhibited by propionate under anaerobic conditions, whereas S. sobrinus and S. mutans were inhibited under aerobic conditions. S. salivarius was inhibited by propionate equally in all conditions described above. Propionate most strongly affected S. mitis growth in shaking conditions. SCFAs regulated oral streptococci biofilm formation. In particular, SCFAs inhibited S. gordonii biofilm formation even at early time points, but did not affect pre-formed biofilms. SCFAs also inhibited S. gordonii competence-stimulating peptide (CSP) gene expression level.

Conclusions

Propionate potently inhibited the growth of S. gordonii under anaerobic conditions. In addition, propionate inhibited the growth of all oral streptococci and the degree of inhibition was dependent on growth conditions. Among the oral streptococci, SCFAs most potently inhibited S. gordonii biofilm. Moreover, acetate inhibited S. gordonii biofilm through inhibition of CSP. Collectively, SCFAs may have the potential as a biocompatible anti-bacterial or anti-biofilm agent for the control of oral streptococci.