Mechanism whereby protein P9, secreted by Akkermansia muciniphila, improves glucose homeostasis and ameliorates metabolic disease

Abstract

Obesity is a multifactorial disease that is characterized by overweight, excessive accumulation of adipose tissue, and loss of glucose homeostasis. Over the past decade, many studies have shown that the gut microbiota plays a role in the pathophysiology of obesity and type 2 diabetes. The best known mechanism whereby the gut microbiota induces obesity is a loss of gut integrity (the leaky gut theory), which increases the plasma lipopolysaccharide (LPS) concentration, and induces systemic low-grade inflammation and obesity. However, the causal links between the mild inflammation generated by the microbiota, metabolic imbalances, and obesity are not firmly established. Numerous studies have identified many bacterial taxa that have positive or negative links to obesity. However, the current challenge in the field is to identify other mechanisms that may include other emerging targets of obesity, such as heat generation by brown adipose tissue (BAT) and the induction of gut hormones, such as glucagon-like peptide-1 (GLP-1). A number of studies have already linked the gut microbiota with metabolic imbalances through bacterially- derived proteins. This leads to the possibility that gut microbe-derived proteins could be specifically targeted to modulate the effects of gut microbes, without causing adverse effects that are connected with other components of the bacteria. Emerging evidence suggests that the gut microbiota regulates BAT activity, which increases glucose uptake and insulin sensitivity. In addition, Akkermansia muciniphila is known to induce the browning of white adipose tissue, and previous studies have shown that it can induce the production of endocannabinoid like-lipids, can in turn induce GLP-1 production. However, the exact mechanism whereby Akkermansia muciniphila has an anti-obesogenic effect remains to be established. In this thesis, I show that the Akkermansia muciniphila-derived protein P9 has an anti-obesogenic effect that is mediated by greater thermogenesis and secretion of GLP-1. These mechanisms were evaluated in three ways. First, I administered P9 daily to high-fat diet-fed mice and interleukin (IL)-6 knockout mice, and showed that the thermogenesis and GLP-1 secretion were IL-6-dependent. Second, I screened the downstream signals that are known to induce GLP-1 secretion and performed a pull-down assay to identify the receptor for the P9 protein, to determine how the effects of GLP-1 are mediated. Third, I aimed to determine whether the anti-obesogenic effect of P9 is GLP-1 signaling-dependent, using GLP-1 receptor (GLP-1r) knockout (KO) mice. Finally, I analyzed the gut microbiome of the P9-treated high-fat diet fed-mice to characterize the relationship between P9 and the microbial community. The P9-fed obese mice showed more normal glucose homeostasis than high-fat diet-fed mice. Notably, the BAT mass was significantly higher, as was the expression of markers of thermogenesis. Moreover, the ileal and systemic concentrations of GLP-1 were significantly higher. Interestingly, previous studies have shown that thermogenesis and GLP-1 induction are related to IL-6 secretion, and consistent with this, the effects of P9 to improve obesity and glucose homeostasis were abrogated in IL-6 KO mice, which confirms that the effects of P9 on GLP-1 and BAT activation are IL-6 dependent. GLP-1 secretion was induced by the P9 protein, but to determine whether this mediated its beneficial effects, I studied GLP-1r KO mice. I found that thermogenesis in high-fat diet-fed mice was dependent on GLP-1, but the secretion of GLP-1 was independent of GLP-1 signaling. In addition, P9 administration affected the composition of the gut microbiota in terms of both alpha and beta diversity. In wild-type mice, the genera Allobaculum, Lactobacillus, and Prevotella were less abundant, whereas Parabacteroides and Bacteroides were more abundant. Furthermore, according to pathway analysis using PICRUSt2 prediction and the MetaCyc database, mevalonate synthesis was lower, and this pathway is known to be dysregulated in diabetes, because mevalonate is part of the cholesterol synthesis pathway. This is consistent with the increase in the abundance of Parabacteroides, which is known to be associated with lower activity of the mevalonate pathway. P9 did not induce GLP-1 secretion through a G-protein-coupled receptor (GPCR), but induced GPCR-like activation of intracellular calcium signaling that was CREB and PLC-mediated. Mass spectrometric analysis of a pull-down assay that was performed using the TriCEPS technique showed that P9 bound to the human ICAM-2 receptor and could activate GPCR-like signaling to induce GLP-1 secretion by the enteroendocrine cells of the host. In addition, to analyze the relationship between IL-6 and ICAM-2, I measured ICAM-2 expression in the ileum, which is the main source of GLP-1, and found that it was downregulated in the IL-6 KO mice. In conclusion, in this thesis, I have provided insight into the mechanisms whereby the novel protein P9 (Amuc_1631), derived from Akkermansia muciniphila, affects glucose metabolism by analyzing its effects on thermogenesis and GLP-1 secretion in high-fat diet-fed, obese mice. P9 binds to the ICAM-2 receptor and activates intracellular calcium signaling, which induces GLP-1 secretion. Furthermore, the anti-obesogenic effects of P9 were dependent on both IL-6 and GLP-1, which implies that crosstalk between the gut microbiota and the host is important for the beneficial metabolic effects of P9. Finally, I have shown that P9-induced GLP-1 secretion improves glucose tolerance, which implies that it may represent an alternative therapeutic target for metabolic disorders.

현재 비만 및 대사질환은 최근 들어서 점점 늘어나고 있는 질환으로써, WHO에서 조사한 결과 2016년 기준으로 현재 전체 인구의 39%가 (BMI 30<) 비만이라는 통계 결과를 냈다 (https://www.who.int/topics/obesity/en/). 최근에 이런 문제를 해결하기 위해 대사질환에 맞는 신약 개발을 하고 있으나, 기존의 방식이었던 식욕저하제 (Appetite suppression drugs), 지방흡수저해제(mal-nutrition drugs) 같은 방법이 아닌 새로운 방법으로 대사질환을 치료하고 하는 노력들이 진행되고 있다. 이런 노력을 바탕으로 현재 장내미생물과 비만의 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 장내미생물은 우리 장에서 함께 공생하고 있는 미생물로써, 여러 통계가 있지만 100조개의 균 정도가 있다고 알려져 있고, 유전자(gene)만으로도 약 3백만정도가 있다고 알려져 있다. 사람과 비교했을 때 사람은 10조개의 세포 그리고 유전자는 23,000개정도만 있다고 알려져 있다. 이렇게 균은 사람과 공생을 하고 있으나, 분명히 건강한 사람과 장기적인 질환을 겪은 사람은 장내미생물의 차이가 있다. 장내미생물과 비만의 상관관계는 2006년 Nature에서 Jeffrey I. Gordon 실험실에서 밝힌 바가 있다. 가장 알려진 장내미생물의 기작으로는 장막이 약화가 되면 리포 다당류 (LPS)에 의한 염증이 비만을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 기작도 중요하지만, 현재 장내미생물이 갈색지방이나 장내 호르몬 같은 GLP-1을 유도한다는 연구 결과들이 보고 되고 있다. 갈색 지방은 원래 영유아에만 영향이 있고, 성인이 되면 사라진다고 생각했었다. 그러나 양전자/컴퓨터단층촬영 (Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET-CT)) 의 발전으로 조금 더 사람을 확인 할 수 있는 기술이 확보가 되면서, 성인에게도 갈색 지방이 여전히 존재하고 있으며, 비만의 정도와 갈색 지방의 양이 상관관계가 있다는 것이 밝혀졌다. 본 연구는 이런 논문들을 바탕으로 장내미생물은 갈색 지방을 활성화 시킬 수 있는 물질이 있을 거라는 가설을 가지고 시작하였다. 이후에 실험에서 얻은 정보를 토대로 장 호르몬인 Glucagon like peptide-1 (GLP-1)이 항비만/당뇨에서 중요한 인자로 장내미생물과 관련이 있는지 연구를 계속 진행하게 되었으며, 갈색 지방을 활성하고 GLP-1을 유도 할 수 있는 인터루킨-6 (IL-6)의 존재도 알게 되었으며, 이러한 항비만 기작들이 과연 장내미생물과 관련성이 있는지 가설을 세우고 실험을 진행하게 되었다. 이런 상관관계에 대한 개념 증명 및 장내미생물과 관련한 항비만/당뇨 및 대사질환 신약발굴을 위해서 연구에 대한 필요성이 있다고 생각합니다. 두 번째 장에서, 본 연구는 아크만시아 뮤시니필라에서 유래한 단백질인 P9을 고지방 식이 마우스에 투여 함으로써, 갈색 지방에 미치는 영향 및 장에 직접적으로 미치는 영향 역시 확인하였다. P9는 고지방 식이 마우스에서 체중감소 및 내당능 효과가 있음을 확인하였다. 이러한 P9의 비만개선은 갈색지방을 통한 열 생산을 유도할 수가 있었으며, 장내 호르몬인 GLP-1을 유도함으로써 이러한 기작들이 대사질환을 완화하는 것을 확인할 수가 있었다. 기존에 연구에서는 IL-6는 아크만시아 뮤시니필라에서 유도가 가능하고, IL-6는 이러한 대사질환에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. P9의 효능이 IL-6의 기반하고 있는 것을 확인하기 위해서 IL-6 녹아웃 마우스를 사용하여 일반적인 마우스에 보였던 체중감소 및 내당능 효과가 있는지 확인해 보였다. 그 결과 IL-6 녹아웃 마우스에서는 체중감소 및 내당능 효과효 사라지는 것을 확인하였으며, 이런 대사질환을 개선할수 있는 GLP-1의 생성능 그리고 열 생산이 IL-6 녹아웃 마우스에서는 사라지는 것을 확인 하였다. 이 연구를 통해 P9는 열 생산 및 GLP-1 생산을 통해서 체중감소 및 열 생성이 가능한 것을 확인하였고, 이런 기작이 IL-6에 의존적인 것을 확인할 수가 있었다. 세 번째 장에서, 본 연구는 아크만시아 뮤시니필라에서 유래한 단백질인 P9이 L cell에서 GLP-1을 생성할 수 있는 기작을 연구하고자 하였다. 기존 연구들은 장내미생물의 기반한 물질들은 GPCR을 통한 신호기작이 중요하다고 알려져 있다. 그러나 본 연구에서는 GPCR에서 보 일수 있는 칼슘 신호 전달이 있음을 확인하고 이것이 CREB과 PLC을 매게하는 것을 확인 하였으나, GPCR에 기반하지 않았음을 확인 하였다. P9의 고아 수용체를 확인하기 위해서 TriCEPs을 이용한 pull down assay를 한 후에 질량분석기를 통해 가능성이 있는 수용체들을 찾아 보았다. 그 결과 키네틴 1 (KTN1) 그리고 인터셀루러 어드히션 몰리큘 2 (ICAM-2) 외 2개가 발견되었다. 각 수용체 맞는 중화항체와 억제 펩타이드를 사용한 후에 GLP-1 생성능을 확인하였을 때, ICAM2를 중화했을 때 P9이 GLP-1 생성능이 억제되는것을 보아 P9는 인간의 ICAM2를 수용체로 해서 GLP-1을 L cell에서 생성하는 것을 확인할수가 있었다. 이로 인해 장내미생물에서 유래한 단백질인 P9이 GPCR이 아닌 다른 수용체이 ICAM-2에 결합해서 칼슘 신호전달을 하는 것을 확인할 수가 있었고, ICAM-2에 새로운 기능을 확인할 수가 있었다. 이어서 ICAM-2에 IL-6과 상관관계를 확인하기 위해서 IL-6 녹아웃 마우스의 소장에서 ICAM-2의 발현을 확인한 결과, ICAM-2가 줄어드는 것을 확인함으로써 ICAM-2가 IL-6와 관계가 있음을 확인할 수가 있었다. 네 번째 장에서, 본 연구는 아크멘시아 뮤시니필라에서 유래한 단백질인 P9이 체중감소 및 내당능이 GLP-1 신호에 기반하는지 확인하는 연구를 진행하였다. 이 연구를 진행하기 위해서 GLP-1r 녹아웃 마우스를 사용하여, P9의 기능이 어떻게 변하는지 확인을 하였다. 나아가서 P9의 의한 장내미생물 변화도 확인하였으며, 이를 비교하기위해 효능이 없을꺼라고 예상한 GLP-1r 녹아웃 마우스를 함께 사용하였다. 예상대로 GLP-1r 녹아웃 마우스에서는 P9에 의한 체중감소 및 내당능이 없어지는 것을 확인하였으며, 이게 갈색지방에 의한 열 생산이 없어지는 것 따른 결과임을 확인하였다. GLP-1r가 없어도 P9에 GLP-1 생성능은 사라지지 않는 것 역시도 확인하였다. P9에 의한 장내미생물 변화는 Allobaculum, Lactobacillus 그리고 Prevotella 가 감소하였고, Parabacteroides 와 Bacteroides가 증가하는 것을 확인하였다. 그리고 PICRUSt2 통한 MetaCyc의 데이터베이스를 기반으로 분석을 하였을때, mevalonate 의 감소가 있음을 확인할 수가 있었다. 이는 기존 연구에 따라 Parabacteroides의 증가에 의한 현상으로 mevalonate는 콜레스테롤의 생성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이로 인해 mevalonate의 억제제가 대사질환에 타겟으로 연구가 되고 있는데, 이런 현상이 P9의 투여에 의해서 일어나는 것을 확인하였다. 따라서, 본 연구는 대사 질환과 장내미생물에 연관성을 확인할 수 있는 연구이고, 장내미생물에서 유래한 단백질인 P9의 L 세포에서의 신호 전달 기작을 확인할 수 있는 연구이다. 이렇게 장내미생물이 ICAM-2라는 사람의 수용체에 결합하여 신호 전달을 할 수 있다는 연구는 본 연구가 처음이며, IL-6와 GLP-1이 대사 질환에 줄 수 있는 영향을 확인할 수 있는 연구이다. 차 후에 이 단백질에 대한 구조 및 임상 연구를 통해 이 단백질이 대사 질환에 사용할 수 있는 신약으로써 의 가능성을 연구를 진행할 예정이다.