Mechanistic Elucidation and Biochemical Modulation of the Autophagic Arg/N-degron Pathway for ER-phagy and Targeted Protein Degradation

Abstract

The N-degron pathway is a proteolytic determinant system that dictates the half-lives of its substrates based on the identity of their N-terminal amino acid residues and/or post-translational modifications. Among the many branches of the N-degron pathway, the arginylation branch can direct substrates for not only proteasomal but also autophagic degradation by virtue of their N-terminal arginine (Nt-Arg) residue. In so doing, the Arg/N-degron pathway regulates global cellular proteostasis. The first part of this thesis will detail a broad overview and general background of the intracellular protein degradation mechanisms for protein quality control, and especially how the Arg/N-degron pathway is intertwined with these mechanisms. The two major degradative machineries are the ubiquitin-proteasome system (UPS) and the autophagy-lysosome pathway (ALP), which respectively degrade proteins via the proteasome and the lysosome. Among these, autophagy can degrade virtually all cellular materials, ranging from DNA to organelles and pathogens, as a selective form of cellular defense and maintenance. First, molecular mechanisms and physiological ramifications of how the autophagic Arg/N-degron pathway mediates endoplasmic reticulum (ER) protein quality control and homeostasis (by selective degradation of the endoplasmic reticulum) will be discussed. Arg/N-degron-mediated ER-phagy facilitates ubiquitin-dependent sequestration and degradation of not only the ER membrane but also the ER lumen and internal proteins. This mechanism can provide a novel avenue of therapeutic targeting against ER proteinopathies whose hallmark proteins aggregate and accumulate within the ER lumen, rendering them inaccessible to the proteasome. Next, based on my work on Arg/N-degron-dependent biochemical modulation of ER-phagy using small-molecule p62 ligands, I present the development of a targeted protein degradation (TPD) platform based on the autophagic Arg/N-degron pathway and its utility against pathological protein species. This platform was coined as AUTOphagy-TArgeting Chimera, or AUTOTAC. Targeted protein degradation, as opposed to functional silencing of proteins, siRNA-mediated interference or mAb therapy, provides a myriad of pharmacological and biological advantages. AUTOTAC is an unique modality even in targeted protein degradation, since it not only delivers the protein-of-interest to the autophagic membrane (a common feature of autophagic degraders) but also simultaneously boosts cellular autophagy. Finally, I will conclude this thesis with an overall summary and discussion of my findings. Elucidating the biochemical and molecular mechanisms of the autophagic Arg/N-degron pathway will provide a framework for maintaining cellular proteostasis and combating proteopathies.

N-말단 법칙(N-degron pathway)은 단백질의 N-말단 아미노산 잔기 혹은 N-말단의 번역 후 수정 (post-translational modification)에 따라 그 단백질의 생체내 분해가 결정되는 시스템이다. 이러한 N-말단 법칙의 다양한 분과들 중, 알지닐화 (arginylation) 분과의 경우, N-말단 알지닌 (Nt-Arg) 아미노산 잔기를 이용해 프로테아좀과 오토파지를 이용한 단백질 분해를 유도한다. 이러한 과정들을 통해 Arg/N-말단 법칙은 세포 내 총체적 단백질대사를 조절하게 된다. 이 논문에서는 세포 내 단백질 분해와 품질관리 (protein quality control)의 기전과 더불어 이 기전과 Arg/N-말단 법칙의 연관성에 대해 구체적으로 다룬다. 대표적인 두가지 분해 기전인 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (UPS) 와 오토파지-리소좀 경로 (ALP)는 각자 프로테아좀과 리소좀을 이용하여 단백질을 분해하게 된다. 그 중에서도 오토파지의 경우, DNA부터 세포 소기관과 병원체까지 사실상 모든 세포 내 물질들의 선택적 분해를 가능케 함으로서 세포내 방어와 유지에 필수적인 기전이다. 이러한 Arg/N-말단 법칙의 분자적 기전과 생리학적 영향이 세포 내 단백질 항상성, 특히 소포체(ER)의 선택적 분해를 통한 소포체 내 단백질 품질 관리와 항상성을 유지함에 대한 내용을 다룬다. 유비퀴틴과 Arg/N-말단 법칙을 통해 일어나는 ER-phagy(소포체-파지)가 소포체 막(ER membrane), 내강(ER lumen)뿐만 아니라 내부에 포함된 단백질들의 격리와 분해를 일으키며, 이러한 기전을 통해 프로테아좀을 통한 분해가 불가했던 소포체 내부의 쌓이고 뭉쳐진 병증 단백질들의 표적이 가능케 함으로서, 소포체 단백질병증 치료에 대한 새로운 장을 열었다. 추가적으로, Arg/N-말단 법칙을 통해 소포체 자가포식을 생화학적으로 저절하는 저분자량 p62 리간드를 이용해 신규 표적 단백질 분해 (targeted protein degradation; TPD) 플랫폼을 제안한다. 이 플랫폼은 병리학적 단백질의 표적분해에 특장점을 가지며 이를 오토텍 (AUTOphagy-TArgeting Chimera; AUTOTAC)이라 명명한다. RNA간섭을 이용한 유전자 침묵이나 항체를 이용한 테라피들 대비, 표적 단백질 분해 플랫폼은 약학적, 생리적 측면에서 크나큰 이점을 가진다. 또한 단백질 표적 분해에 있어 표적하는 단백질을 오토파지 막으로 배달하는 오토파지를 이용한 일반적 분해제들과는 달리 오토텍은 단백질 배달-분해와 동시에 세포 내 오토파지 자체를 신장시키는 특징적 양상을 가진다. 마지막으로, 상기 연구 결과들에 대한 개괄적 요약과 고찰을 통해 논문을 마무리한다. 오토파지를 관장하는 Arg/N-말단 법칙의 분자 생화학적 기전 연구를 통해 세포 내 단백질 항상성 유지와 단백질병증 타파에 대한 틀을 제공할 것이다.