사이토카인 발현과 상피간엽이행을 통한 톨-유사 수용체4의 장 섬유화 조절

Abstract

Intestinal fibrosis induced by chronic and recurrent colitis, which is exacerbated by bowel stenosis, stricture, and obstruction, is challenging to treat. A dextran sulfate sodium (DSS)-induced murine fibrosis model was the most convenient and popular experimental model but the duration and frequency of DSS administration were not well known. We established an experimental protocol for DSS-induced murine fibrosis model. We compared the severity of fibrosis between one and three cycles of 6-day-DSS treatment. A cycle of DSS sufficiently provoked colonic fibrosis. Toll-like receptor 4 (TLR4) stimulates innate and acquired immunity in response to specific microbial components, but the role of TLR4 in intestinal fibrosis is largely unknown. We investigated its role in intestinal fibrosis using not only a murine fibrosis model but also human myofibroblasts and intestinal epithelial cells. Colon fibrosis was induced in TLR4-deficient (TLR4-/-) mice and its wild-type counterparts with 3% dextran sulfate sodium. Absence of TLR4 gene attenuated chronic inflammation and colonic macrophages infiltration; intestinal fibrosis and collagen deposition were suppressed. Also, the production of transforming growth factor-β, tumor necrosis factor-α, and interleukin-12p40 was reduced in TLR4-deficient peritoneal macrophages. TLR4 was silenced in CCD-18Co cells by small interfering RNA (siRNA), and matrix metalloproteinase-1, tissue inhibitor of metalloproteinase, and collagen α1 expression was evaluated. Role of TLR4 in epithelial-mesenchymal transition (EMT) was evaluated in HCT116 cells. Suppression of TLR4 transcription by siRNAs affected myofibroblasts activity, collagen synthesis, and EMT in the human cancer cell line. Thus, we suggest that TLR4 can be an essential mediator in intestinal chronic inflammation and fibrosis, indicating that TLR4 signaling is a potential therapeutic target for intestinal fibrosis. And our protocol of DSS administration can help other scientists to provoke intestinal fibrosis by DSS treatment effectively.

장 섬유화는 만성적이고 반복적인 장염으로 인해 발생하며, 협착과 폐쇄를 유발할 수 있으나 그 치료가 어려운 실정이다. 톨-유사 수용체 4 (TLR4)는 특정 미생물의 구성성분에 반응하여 선천 및 획득면역을 자극할 수 있지만 장 섬유화에서 TLR4의 기능은 거의 알려져 있지 않다. 그래서 우리는 마우스 섬유화 모델과 인간 근섬유아세포, 장 상피세포를 이용하여 장 섬유화에서 TLR4의 역할에 대해 연구하였다. TLR4에 대한 본격적인 연구에 앞서 DSS-유도 마우스 장 섬유화 모델에 대한 연구부터 하였다. 마우스를 이용한 장 섬유화 실험모델에서 DSS를 많이 사용하지만 DSS-유도 장 섬유화 모델에서 적절한 DSS의 처리 기간은 아직 잘 확립되지 않은 실정이다. 그 결과 6일간의 3% DSS 투약만으로도 충분히 장 섬유화가 발생하였다. TLR4-결핍 (TLR4-/-) 마우스와 야생형 마우스에 3% dextran sodium sulfate를 처리하여 장 섬유화를 유발하였다. 야생형 마우스에 비해 TLR4-/- 마우스에서 만성 염증과 장으로의 대식세포 유입이 감소하였고 장 섬유화와 콜라겐 축적 또한 억제되었다. 또한 TLR4-/- 마우스의 복강 내 대식세포에서 종양 괴사 인자-α, 인터루킨-12p40, 형질전환 생장 인자-β의 발현이 감소되어 있었다. 작은 간섭 리보핵산 (small interfering RNA, siRNA)을 처리하여 CCD-18Co 세포에서 TLR4의 발현을 억제한 후 기질 금속단백질 가수분해효소-1 (matrix metalloproteinase-1, MMP-1), 금속단백 분해효소 조직억제제 (tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP) 콜라겐 α1의 발현을 평가하였다. TLR4 siRNA가 처리된 경우 기질 금속단백질 MMP-1와 콜라겐 α1의 발현은 감소하고 TIMP의 발현은 증가하였다. 그리고 HCT 116 세포에 TLR4 siRNA를 처리하자 상피간엽이행이 억제되었다. 이 연구를 통해 TLR4가 장의 만성 염증과 섬유화에 필수적인 물질임을 밝혔으며 TLR4는 향후 장 섬유화에 대한 치료 표적이 될 수 있을 것이다. 또한 우리가 정립한 DSS-유도 마우스 장 섬유화 모델은 다른 연구에서 장 섬유화를 유발하는데 도움이 될 것이다.