Type 2 diabetes and DNA methylation Changes as Risk Factors of Occurrence and Prognosis

Abstract

제2형 당뇨는 췌장의 베타 세포 (beta cell)의 기능 장애와 인슐린 저항성으로 인한 고혈당증을 특징으로 하는 만성질환이다. 한국의 제2형 당뇨 유병률은 성인의 12.4%에 달하고 있다. 제2형 당뇨는 유전적 요인과 환경적 요인, 그리고 두 요인의 상호작용으로 인해 발생한다고 알려져 있지만, 추정유전율이 25~69%에 달하는 것에 비해 전장유전체분석 (Genome-wide association study, GWAS)를 통해 확인한 변이 (genetic variants)는 추정 유전율의 일부만을 설명할 뿐이다. 이러한 관점에서 유전적 요인과 환경적 요인의 상호작용을 밝히기 위해 후성유전학적 연구가 활발히 진행되고 있다. 후성유전(Epigenetics)는 DNA 염기서열의 변화 없이 유전자 발현에 영향을 주는 현상을 의미하며, 이는 생애에서 노출되는 환경적인 요인으로 인해 영향을 받는다고 알려져 있다. 후성유전의 대표적인 기전은 DNA 메틸화 (DNAm)와 히스톤 변형 (Histone modification)이 있다. 최근 연구에서는 DNA 메틸화를 포함한 후성유전학적 변화가 제2형 당뇨 및 미세 혈관 합병증의 발병 위험에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 뿐만 아니라, 고혈당에의 노출이 DNA 메틸화의 변화를 일으키고 나아가 당뇨병성 신장질환의 위험을 증가시킨다는 대사성 기억 (metabolic memory) 현상이 제기됨에 따라 제2형 당뇨에서의 DNA 메틸화 변화에 대한 연구의 중요성이 증가하고 있다. 따라서 본 연구는 한국인에서 제2형 당뇨와 당뇨병성 신장질환 (Diabetic kidney disease, DKD) 특이적인 DNA 메틸화 지표를 발굴하고 해당 지표들과 대사성 특성(metabolic trait)과의 연관성을 탐구하고자 수행되었다. 먼저, 전장메틸화영역 연관분석 (Methylome-wide association study)을 통해 제2형 당뇨 유병여부에 따른 DNA 메틸화 차이를 관찰하고 차이가 특이적인 지표를 발견하는 분석을 수행하였다. 해당 지표들을 이용해 DNA 메틸화 점수를 계산하였고, 이 점수에 따라 10년간 추적 관찰한 대상자들에게서 제2형 당뇨병의 발생이 차등적으로 관찰되는지에 대한 분석을 수행해 제2형 당뇨 특이적 DNA 메틸화 분석결과의 신뢰성을 확보하였다. 또한, 같은 분석방법을 사용해 당뇨병성 신장질환 특이적인 DNA 메틸화 지표를 발견하는 분석이 이어서 수행되었다. 마지막으로, 발견된 제2형 당뇨/당뇨병성 신장질환의 DNA 메틸화 마커와 대사성 특성의 연관, 인과관계를 분석해 제2형 당뇨에서의 DNA 메틸화의 기전을 밝히고자 하였다. 말초 혈액 백혈구 샘플에서 DNA를 추출한 후, KoGES 코호트의 356 명과 HTS 코호트의 일부 대상자는 Illumina 사의 Infinium HumanMethylation 450 BeadChip으로 어세이 되어 유전체 내 약 450,000 개 이상의 DNA 메틸화 위치에 대한 DNA 메틸화 수준의 데이터를 얻었으며, 일부 HTS 코호트 대상자와 서울대병원 당뇨 코호트의 대상자들은 Illumina 사의 Infinium Methylation Epic Beadchip으로 어세이되어 유전체 내 총 850,000개 이상의 DNA 메틸화 수준의 데이터를 얻을 수 있었다. 이 중 Infinium HumanMethylation 450 BeadChip으로 어세이 된 자료들은 DNA 메틸화 마커 대치 (imputation) 방법 중 하나인 methylImp를 사용하여 주변 마커들과의 상관관계를 이용한 원리로 대치되어 총 850,000개 이상의 마커를 얻을 수 있었다. 본 연구에서는 197명의 제2형 당뇨병 대상자와 232명의 비 당뇨병 대조군을 사용한 사례-대조 연구 설계 (서울대병원 당뇨 코호트)에서 전장메틸화영역연관분석을 수행하였다. 제2형 당뇨병 그룹은 87명의 당뇨병성 신장질환 대상자와 80명의 비당뇨병성 신장질환군 (제2형 당뇨 유병 기간 10년 이상의 환자로 환장)으로 세분화되었다. 추가적으로 한국인 가족-쌍둥이 (HTS) 코호트 및 한국인유전체역학조사사업 (KoGES) 코호트의 2 개의 인구 기반 코호트에서 추가로 819 명의 대상자를 사용하여 발견된 DNA 메틸화 지표와 대사성 특성의 연관성을 조사하였다. 대사성 특성과 DNA 메틸화 지표의 인과 관계를 조사하기 위해 멘델리안 무작위 분석방법 (Mendelian randomization, MR)이 적용되었다. 본 연구에서는 제2형 당뇨의 8 개의 차등메틸화 영역 (Differentially methylated site, DMS) (각각 BMP8A, NBPF20, STX18, ZNF365, CPT1A, TRIM37 및 TXNIP에서 2 개)을 DNA 메틸화연구에서의 유의성 임계값(P <9.0x10-8)에서 확인했으며 이 중 TXNIP과 CPT1A에 위치한 3 개의 차등메틸화 영역은 기존 연구에서 확인된 영역이었다. 8개의 DNA 메틸화 마커로 구성된 DNAm 점수를 개인별로 계산하였으며, DNAm 점수의 1분위와 10분위의 상대적 위험이 2.86 (95% 신뢰구간 1.10-7.44) 으로 나타났다. 전장메틸화연관분석이 수행된 것과 독립적인 전향 코호트 (KoGES)에서 제2형 당뇨병 발병 위험을 예측할 수 있어, 발견된 제2형 당뇨 특이적인 DNA 메틸화 마커의 신뢰성을 확보할 수 있었다. 멘델리안 무작위분석 방법을 이용하여 제2형 당뇨와 관련된 차등메틸화영역은 당뇨병 발병에 인과적인 효과가 없다는 것을 확인하였다. 이 과정에서 이용된 내생변수로 DNA 메틸화 정량 유전자좌 (methylation quantitative loci, mQTL)를 사용하였는데, 이 중 선행된 전장유전체 분석에서 보고된 제2형 당뇨와 대사특성 관련 단일염기다형성 (Single nucleotide polymorphism, SNP)이 발견되었다. 이는 해당 DNA 메틸화 정량 유전자좌와 관련이 있는 차등메틸화영역과 제2형 당뇨의 연관성에 교란효과가 있을 수 있음을 시사한다. CPT1A 및 TXNIP의 DMR은 공복 혈당, HbA1c 및 체질량 지수를 포함한 정량적 대사 특성과 관련이 있었으며, 특히 CPT1A의 DNA 메틸화는 공복 혈당에 인과적으로 조절되는 것으로 보였다. 또한 167명의 당뇨병성 신장 대상자 및 비 당뇨병성신증 대조군의 전장메틸화연관분석 연구에서 당뇨병성 신장질환과 관련된 3 개의 차등메틸화 영역(COMMD1, TMOD1 및 FHOD1)을 확인할 수 있었다. 당뇨병성 신장질환의 차등메틸화영역은 제2형 당뇨병에서 발견된 차등메틸화영역과 통계적으로 의미 있는 수준에서 공통적인 부분을 발견할 수 없었다. 당뇨병성 신장질환의 차등메틸화 영역은 유전변이에 의해 많은 부분이 설명 되고 있었으며, 멘델리안 무작위분석방법을 통해 당뇨병성 신장질환에 인과적인 영향을 미치고 있음을 확인할 수 있었다. 추정된 사구체 여과율 (eGFR)은 당뇨병성 신장질환에서 발견된 3개의 차등메틸화 영역과 인과 관계가 관찰되었다. 결론적으로, 우리는 동아시아 인구에서 제2형 당뇨병과 관련된 8 개의 차등메틸화영역을 메틸화연구에서의 유의성 임계값 (P <9.0x10-8)에서 발견하였으며 이 중 5개는 본 연구에서 새롭게 밝혀진 DNA 메틸화 지표이다. 또한 당뇨병성 신장질환과 관련된 3개의 차등메틸화영역을 확인하였으며, 이는 제2형 당뇨의 영역과는 공통적인 부분이 발견되지 않았다. 본 연구 결과는 당뇨병성 신장질환의 후성유전학적 기전이 제2형 당뇨의 기전과는 다를 것임을 시사한다.

Objective: There is growing body of evidence that epigenetic changes including DNA methylation (DNAm) influence the risk of type 2 diabetes and its microvascular complications. We conducted a methylome-wide association study (MWAS) to identify differentially methylated regions (DMRs) of type 2 diabetes and diabetic kidney disease (DKD) in Korean population. Methods: We performed an initial MWAS in 232 participants in a case-control study design with type 2 diabetes and 197 non-diabetic controls with Illumina EPIC bead chip using peripheral blood leukocytes. Type 2 diabetes group was subdivided to 87 DKD cases and 80 non-DKD controls. Additional 819 individuals from two population-based cohorts were used to investigate the association of the identified DMRs with quantitative metabolic traits. We developed a DNAm score using identified DMRs to predict the occurrence of type 2 diabetes. To examine the causal relationship between differentially methylated CpGs and type 2 diabetes/DKD and between the metabolic traits and differentially methylated status, we performed Mendelian randomization (MR) analyses. Results: We identified eight DMRs (each at BMP8A, NBPF20, STX18, ZNF365, CPT1A, and TRIM37, and two at TXNIP) which were significantly associated with risk of type 2 diabetes (P < 9.0×10-8), including three that were previously known (DMRs in TXNIP and CPT1A), in 429 type 2 diabetes cases and controls. DNAm score consisted of these DMRs differentiated the risk of developing type 2 diabetes in an independent prospective cohort with a relative risk of 2.86 (95% CI 1.10-7.44) between the lowest and highest deciles of DNAm score. DMRs in CPT1A and TXNIP were associated with quantitative metabolic traits, including fasting glucose, HbA1c, and body mass index. DMRs of type 2 diabetes have little methylation quantitative loci (mQTL), and not causally associated with type 2 diabetes. Three DMSs of type 2 diabetes (cg26823705, cg08867893, and cg17082373) affect the increase of HbA1c level. We also identified three DMRs (on COMMD1, TMOD1, and FHOD1) associated with DKD in 167 DKD cases and controls. DMRs of DKD did not show meaningful overlap with those of type 2 diabetes. DKD was causally affected by methylation changes of DMRs of DKD, which was highly influenced by genetics. In MR analysis, the estimated glomerular filtration rate was causally associated with DNAm of these three DMRs. Conclusions: In an East Asian population, we identified eight DMRs, including five novel ones, associated with type 2 diabetes and three DMRs associated with DKD at methylome-wide statistical significance. Our findings suggest that epigenetic machinery of DKD may be different from that are responsible for the development of T2D.