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Preventive effects of dichloroacetate on renal ischemia-reperfusion injury-induced oxidative stress and inflammation in diabetic mice
Dichloroacetate가 신장 허혈-재관류 손상으로 인한 산화스트레스와 염증 발생에 미치는 예방적 효과

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Authors
강아름
Advisor
최성희
Issue Date
2021
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
ischemiareperfusiondiabetesacute kidney injurypyruvate dehydrogenase kinase 4dichloroacetic acidreactive oxygen speciesinflammation허혈재관류급성신장손상피루베이트 탈수소효소 키나 아제4디클로로아세트산반응성 산소종염증
Description
학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 의과대학 의학과, 2021.8. 최성희.
Abstract
배경 당뇨병성 신장 질환은 만성 질환의 주요한 원인이며, 급성 신장 손상의 발생을 유도하는 허혈성 손상에 대한 민감도가 증가하는 것으로 알려져 있다. 반응성 산소종을 생성하는 중요한 세포내 소기관인 미토콘드리아는 급성 신장 손상의 주된 이유인 허혈-재관류 손상의 발병 기전에 핵심적인 역할을 하는 것으로 보고되었다. 이 연구는 미토콘드리아 기질 효소 중 하나인 pyruvate dehydrogenase kinase 4 (PDK4) 가 허혈-재관류 급성 신장 손상 후 발생하는 반응성 산소종과 염증에 끼치는 영향을 streptozotocin-유발 당뇨병 쥐에서 조사하고자 한다.
방법 9주령의 수컷 C57BL/6J 쥐에 streptozotocin 50 mg/kg 를 5일 연속으로 복강내 주사하여 당뇨병 동물 모델을 확립하였다. 고혈당이 확인된 25 마리의 C57BL/6J 쥐를 아래와 같이 분류하였다. 대조군 (6마리), STZ 유발 당뇨병 쥐군 (7마리), STZ 유발 당뇨병 쥐 중 허혈-재관류 손상을 받은 군 (6마리), 그리고 허혈-재관류 손상을 받기 전 dichloroacetate (DCA)를 5주간 250 mg/kg 로 복강 내 주사한 군 (6마리)으로 나누어 PDK4 의 mRNA 및 단백질 발현 정도를 비교하였다. 허혈-재관류 손상은 양쪽 신장의 혈류를 죔쇠로 37분간 고정한 후 다시 죔쇠를 풀고 24시간동안 재관류하여 허혈-재관류 신손상 모델을 구축하였다. 저산소실 (hypoxia work station)을 이용하여 NRK-52E 세포와 배양한 일차 쥐신세뇨관세포 (mouse primary tubular cells)에 허혈-재관류 손상을 주어, 신장 세포의 세포사멸사, 반응성 산소종의 생성, 그리고 염증 지표를 조사 및 비교하였다.
결과 당뇨병 쥐의 신장 허혈-재관류 손상 후 다른 PDK 동형단백질은 증가하지 않았으나, PDK4는 뚜렷하게 증가하였고, PDK4의 표적 단백질인 pyruvate dehydrogenase E1α (PDHE1α)의 인산화도 유의미하게 증가하였다. 이와 함께 당뇨병 쥐의 신장 조직 및 NRK-52E 세포에서 신장 허혈-재관류 손상 후 반응성 산소종의 증가, 종양괴사인자-α (tumor necrosis factor, TNF-α), 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6), 인터루킨-1β (interleukin-1β, IL-1β) 그리고 단핵구화학주성단백-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)의 유도가 동반되었다. PDK 억제제인 DCA 치료시 PDK4 단백질 발현 및 PDHE1α의 인산화가 뚜렷이 감소하였으며, 신장 허혈-재관류 손상 유도 cleaved caspase-3 가 DCA 의 용량 의존적으로 감소하며 세포 사멸 또한 감소됨이 관찰되었다. DCA 혹은 small hairpin PDK4 (shPDK4)를 사용한 PDK4 의 억제는 허혈-재관류 손상 후 반응성 산소종의 생성 증가를 약화시켰으며 염증 지표인 TNF-α, IL-6, IL-1β 그리고 MCP-1을 감소시켰음을 확인할 수 있었다. 이에 더하여 DCA 혹은 shPDK4 의 사용은 신장 허혈-재관류 손상으로 인한 미토콘드리아의 최대 산소소비량 (oxygen consumption rate)을 의미 있게 증가시키고, 전자전달계의 complex III 및 complex V 의 단백질 발현을 증가시켜, ATP의 생성을 개선시키는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과는 PDK4 관련 반응성 산소종의 생성, 염증 유발, 그리고 미토콘드리아의 기능 이상이 허혈-재관류로 인해 발생하는 신장 손상에 중요한 역할을 함을 의미한다.
결론 PDK4 억제시 신장 허혈-재관류 손상으로 발생하는 반응성 산소종의 생산 및 염증 유도를 감소시켜 결과적으로 미토콘드리아 기능 이상을 개선시킴으로써 신장 손상의 정도를 경감시킬 수 있었다. 이를 통해서 신장 허혈-재관류 손상에서 PDK4가 결정적인 역할을 하고 있음을 확인할 수 있었다. PDK4는 허헐-재관류로 인한 급성 신장 손상에서 신장 기능을 보존하는 데 활용할 수 있는 중요한 표적이 되므로 추후 연구를 통해 PDK4의 억제가 급성 신장 손상에서 발생하는 미토콘드리아 기능 및 역학적 변화에 어떠한 영향을 미치는지에 대해 살펴볼 필요가 있다.
Background
Diabetic kidney disease is one of major causes of chronic kidney disease, in which the vulnerability of ischemic insult increases, leading to an acute kidney injury (AKI). Mitochondria, a well-known source of reactive oxygen species (ROS), plays a fundamental role in the pathogenesis of ischemia-reperfusion (IR) injury, which is a leading cause of AKI. Pyruvate dehydrogenase kinase 4 (PDK4) is a mitochondrial matrix enzyme. In this study, the roles of PDK4 in the production of ROS and inflammation after ischemic AKI was investigated.
Materials and Methods
A streptozotocin (STZ)-induced diabetic male C57BL/6J mouse model undergoing ischemia and reperfusion by clamping both renal pedicles was used: sham controls (n = 6), in which the kidneys were surgically exposed; STZ-induced diabetic mice (n = 7); STZ-induced diabetic mice with IR injury(n = 6), in which the kidney were exposed and both renal pedicles were clamped for 37 min and reperfused for 24 h; and STZ-induced diabetic mice with dichloroacetate (DCA, 250 mg/kg, intraperitoneal) treatment and IR injury (n = 6). The cellular apoptosis, production of ROS and inflammatory markers in NRK-52E and mouse primary tubular cells after hypoxia and reoxygenation using a hypoxia work station in vitro were evaluated.
Results
The expression of PDK4, not the other PDK isoforms, was induced after IR injury in the diabetic mice, followed by a marked increase in pyruvate dehydrogenase E1α (PDHE1α) phosphorylation. This was accompanied by induction of heightened activation of ROS and the production of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β), and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). The renal IR injury-induced apoptosis was attenuated upon treatment with DCA, a PDK inhibitor, due to decrease in the expression of PDK4 and phosphorylation of PDHE1α after IR injury. The treatment with either DCA or shPDK4 reduced the burden of oxidative stress and decreased the production of TNF-α, IL-6, IL-1β and MCP-1 after IR injury. Consequently, the maximal respiration of mitochondria and protein expression levels of complex III and V upon IR injury showed improvement after treatment with DCA or shPDK4 in NRK-52E cells. These results suggest that the renal IR injury involves the PDK4-related production of ROS, inflammation, and consequent mitochondrial dysfunction.
Conclusion
Inhibition of PDK4 diminished renal injury, decreased the production of ROS and inflammation, and improved the mitochondrial dysfunction, thereby revealing the critical roles of PDK4 in ischemic reperfusion damage. This study provides another potential target for reno-protection during IR injury. The specific effects of the inhibition of PDK4 on the mitochondrial dynamics and pathogenesis of renal IR injury need to be further elucidated.
Language
eng
URI
https://hdl.handle.net/10371/178888

https://dcollection.snu.ac.kr/common/orgView/000000167255
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