Regulation of glutamate release by presynaptic Ca2+ channels and K+ channels

Abstract

Neurotransmitter release occurs either synchronously to action potentials or spontaneously, yet whether molecular machineries underlying evoked and spontaneous release are identical, especially whether voltage-gated Ca2+ channels (VGCCs) can trigger spontaneous events has been in debate. To elucidate this issue, we characterized Ca2+ dependency of miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs), in autaptic cultured hippocampal neurons. I found that spontaneous release shows Ca2+ cooperativity comparable to evoked release, and most of [Ca2+]o-dependent mEPSCs was attributable to CaV2 family VGCCs. Coupling distance between VGCCs and Ca2+ sensors was estimated as tight for both types of release. Moreover, I explored the experimental evidence for contribution of L-type Ca2+ channels (LTCCs) on spontaneous release. The spontaneous exocytosis mechanism of this channel was somewhat different from CaV2 family. The coupling distance between LTCCs and Ca2+ sensors was longer than that of CaV2 family which was tested by 10 mM [EGTA]i. Therefore, I suggested that the spontaneous release might be affected by global [Ca2+] which was regulated by LTCCs. In addition, the mechanism for global [Ca2+]-dependent spontaneous release was mediated by calmodulin (CaM)-dependent synaptic vesicle exocytosis. In addition, I found that presynaptic voltage-gated K+ channels (VGKCs) regulate spontaneous glutamate release. The role of KV7 is mediated specifically by regulating LTCCs, while the role of KV1 is mediated specifically by regulating P/Q-type VGCCs, suggesting the specific coupling between VGKCs and VGCCs. Taken together, my study reveals subtype-specific mechanisms of VGCCs and VGKCs in regulating spontaneous glutamate release.

시냅스 말단에 도달한 활동 전위에 의해 유발되는 신경 전달 물질의 방출은 신경 세포 사이의 신호 전달의 핵심 과정이다. 또한 휴지기 상태에서도 자발적으로 신경 전달 물질이 방출되며, 이 자발적 방출은 시냅스의 성숙 및 유지, 항상성 및 가소성에서 중추적인 역할을 한다. 자발적 방출의 기본이 되는 분자 기전은 활동 전위에 의해 유발된 신경 전달 물질의 방출과 동일한지 여부는 아직 많은 것이 밝혀지지 않았다. 이번 연구는 단일 신경세포가 스스로 시냅스를 이룰 수 있게 배양 된 해마의 흥분성 신경 세포 (autaptic hippocampal excitatory neuron)에서 전압 클램프를 이용하여 -70 mV에서 측정 된 미니어쳐 흥분성 후시냅스 전류 (mEPSC)의 유발 빈도를 분석하여 자발적 글루탐산 방출에 대한 전압 의존적 칼슘 이온 통로 (voltage-gated Ca2+ channel)의 기여를 관찰하였다. ω-Agatoxin-IVA, ω-Conotoxin GVIA 및 SNX-482 또는 100 μM NiCl2를 사용한 P/Q-, N- 및 R- 형 칼슘 이온 통로의 차단은 mEPSC 유발 빈도를 29%, 27% 및 23%로 크게 감소 시켰다. 또한 세 가지 칼슘 이온 통로 차단제의 동시 적용 또는 세포 외용액의 칼슘 이온 제거는 mEPSC 유발 빈도를 60% 감소 시켰으며, 이는 자발적 방출의 60 %가 칼슘 이온 통로를 통한 칼슘이온의 유입에 의해 매개됨을 시사한다. 세포 외부 칼슘 이온 농도에 대한 칼슘 이온 통로 의존성 mEPSC 유발 빈도의 log-log 그래프에서 기울기는 1.24였으며, 이는 자발적 방출에 대한 칼슘 이온의 cooperativity를 시사한다. mEPSC의 방출 빈도는 5mM EGTA에 의해 크게 영향을 받지 않았지만, BAPTA에 의해 감소했다. BAPTA 농도가 0.5mM에서 1mM 및 5mM으로 증가함에 따라 감소 속도가 더 빨라짐을 관찰하였다. BAPTA에 의한 mEPSC 방출 빈도의 농도 의존적 감소로부터 추정 된 시냅스 소포체의 칼슘 감지 단백질과 칼슘 이온 통로 사이의 거리는 약 20 nm로 관찰되었다. 종합하면, 칼슘 이온 통로의 확률적 개방은 전압 의존적 칼슘 이온 통로와 시냅스 소포체의 칼슘 감지 단백질 사이의 나노 도메인 결합에 의해 자발적 글루탐산 방출을 유발한다. 다음으로, 자발적 방출에 대한 글로벌 칼슘 이온 농도의 영향을 알아보기 위해 전압 클램프의 막전압을 조절하여 다양한 막전압에서 mEPSC 유발 빈도를 기록하였다. 탈분극 된 막전압은 mEPSC 유발을 증가시키지만, L-형 칼슘 이온 통로의 차단 또는 항진을 하게 되면 탈분극에 의한 mEPSC 유발 빈도의 증가가 사라짐을 발견하였다. 더욱이, 칼모듈린 억제 펩티드를 처리하여 칼모듈린 의존적 시냅스 소포의 세포외방출을 억제하면, L-형 칼슘 이온 통로에 의한 mEPSC 유발빈도가 나타나지 않음을 관찰하였다. 따라서, L-형 칼슘 이온 통로는 글로벌 칼슘 이온 농도를 조절하여 칼모듈린 의존적 시냅스 소포 세포외방출 경로를 통해 자발적 글루탐산 방출을 일으킬 수 있음을 제시한다. 마지막으로 자발적 글루탐산 방출에 대한 칼륨 이온 통로와 칼슘 이온 통로 사이의 관계를 관찰하였다. 전시냅스 말단에서 전압 의존적 칼슘 이온 통로의 확률적 개방은 소포체 방출을 유발하는 것으로 알려져 있지만, 명확한 작용기전은 잘 알려진 바 없다. 휴지 상태의 전시냅스 말단에서 칼륨 이온 통로가 칼슘 이온 농도에 미치는 역할은 휴지 막 전위 (RMP)의 변화에 기인하는 것으로 생각되지만 직접적인 실험 증거는 부족한 바 이다. 본 연구는 RMP에 대한 칼륨 이온 통로의 효과와 자발적 글루탐산 방출 사이에 상당한 차이가 있음을 발견하였고, 특정 칼륨 이온 통로가 전시냅스 말단에서 특정 칼슘 이온 통로를 조절할 수 있는 새로운 기전에 대한 증거를 제시한다.