Structural and Biochemical Analysis of Pseudouridine Kinase from Arabidopsis thaliana

Abstract

RNA의 변형은 종류가 매우 다양하며 각각 RNA들의 안정성, mRNA와 단백질들간의 상호작용 그리고 단백질로의 번역과정에 효율성을 조절하는 등 다양한 역할을 담당한다. 대부분의 경우, RNA의 변형은 효소들에 의해서 특정 RNA에 부위 특이적으로 일어난다. 이들의 생물학적 역할, 생합성과정 관련 연구들과 비교해 변형된 RNA 의 분해 관련 연구는 비교적 미비하다. 가장 많이 발견되는 RNA 변형중 하나인 pseudouridine의 대사 관련 효소들이 최근 애기장대에서 동정이 되었다. 애기장대에서는 두개의 효소에 의해 pseudouridine의 분해를 촉매된다: PSEUDOURIDINE KINASE (PUKI) 와 PSEUDOURIDINE MONOPHOSPHATE GLYCOSYLASE (PUMY). PUKI와 PUMY는 pseudouridine을 pseudouridine monophosphate로 인산화 시키는 과정과 pseudouridine monophosphate를 uracil과 ribose 5-phosphate로 가수분해하는 과정을 각각 촉매 한다. 차례로 해당 산물들은 pyrimidine의 일반적인 대사과정이나 재활용 과정에 사용된다. 본 학위논문에서는 pseudouridine 분해의 첫번째과정을 담당하는 효소인 애기장대 유래 PUKI의 단백질 삼차 구조를 분석하고, 규명된 단백질의 구조를 기반으로 기질 특이성에 관련된 인자들을 밝히고자 한다. AtPUKI는 PfkB family에 속하는 carbohydrate kinase로써, homodimer가 생물학적 기능 단위이다. 구조적인 특징으로는 α/β domain를 중심으로 가지고 있으며, 이로부터 유래한 β-strand domain로 구성이 되어있다. 흥미롭게도, β-strand domain는 dimerization interface를 제공하는 동시에 기질 특이성을 결정짓는 역할을 수행한다. AtPUKI, pseudouridine 그리고 ATP 결합구조를 토대로 AtPUKI에는 pseudouridine이 결합할 수 있는 독특한 결합부위가 존재하며, 이는 여러 개의 친수성 아미노산들에 의해 매개가 되는 것을 확인하였다. 특히, 인접한 단량체의 β-strand domain로부터 유래한 loop 또한 기질의 특이성을 결정짓는데 중요한 역할을 하며, 구조적인 변화의 수반이 요구된다는 것을 제시하였다. 이러한 동적인 특징은 AtPUKI가 uridine보다 pseudouridine에 높은 촉매 효율을 보이는 이유를 잘 설명한다. 두 기질들은 모두 AtPUKI와 비슷한 결합 친화도를 보이며 잘 결합하지만, 오직 pseudouridine만이 AtPUKI의 구조적인 변화를 야기하며 효소에 의해 효율적으로 분해된다(높은 turnover rate)는 것을 제시했다. 이러한 결과들은 어떻게 AtPUKI가 uridine을 포함하는 다른 pyrimidine nucleoside의 항상성을 방해하지 않고, pseudouridine의 인산화에만 관여하는지를 잘 설명하며, 더 나아가 PfkB family에 속하는 다양한 효소들의 구조적 그리고 기능적 다양성의 예시로서 사용될 수 있다.

RNA modifications are chemically diverse site-specific events, achieved in most cases through an enzyme-dependent reaction. They regulate the stability of RNAs, mRNA–protein interactions, and translation efficiency. Compared to studies related to the biological role and biosynthesis process of RNA modifications, studies on the degradation of modified RNA are relatively incomplete. Recently, metabolic fate of pseudouridine, one of the most prevalent modified RNAs, was characterized in plant Arabidopsis thaliana. In the A. thaliana, two enzymes are responsible for pseudouridine degradation: PSEUDOURIDINE KINASE (PUKI) and PSEUDOURIDINE MONOPHOSPHATE GLYCOSYLASE (PUMY). PUKI and PUMY are involved in phosphorylating pseudouridine into pseudouridine monophosphate and hydrolyzing pseudouridine monophosphate into uracil and ribose 5-phosphate, respectively. The resulting products can be subjected to a general pathway for pyrimidine catabolism or the salvage pathway. In this thesis, I conducted structural and biochemical analyses of PUKI from A. thaliana (AtPUKI), the enzyme catalyzing the first step in pseudouridine degradation. AtPUKI, a member of the phosphofructokinase B (PfkB) family of carbohydrate kinases, is a homodimeric α/β protein with a protruding small β-strand domain, which serves simultaneously as dimerization interface and dynamic substrate specificity determinant. AtPUKI has a unique nucleoside binding site specifying the binding of pseudourine, of which one is mediated by a loop from the small β-strand domain of the adjacent monomer. Conformational transition of the dimerized small β-strand domains containing active site residues is required for substrate specificity. This dynamic feature explains the higher catalytic efficiency for pseudouridine over uridine. Both substrates bind well to the AtPUKI with similar Km value, but only pseudouridine is turned over efficiently. These results provide an example for structural and functional divergence in the PfkB family and highlight how AtPUKI avoids futile uridine phosphorylation which in vivo would disturb pyrimidine homeostasis.