Studies on Antimicrobial Activity and Mode of Action of Metabolites from Marine-derived Streptomyces bacillaris MBTC38

Abstract

Actinobacteria are attractive phylum to produce various secondary metabolites with promising biological activities. Especially, marine-derived actinobacteria have been expected to produce metabolites with novel structure and mechanisms due to their unique circumstances. The present thesis evaluates biological activities of natural products from marine Streptomyces and investigates action mechanism of those compounds. The first part deals with estimation of antibacterial activities of four lactoquinomycins and identification of their mode of action. Lactoquinomycin A (LQM-A) (compound 1) and its derivatives (2–4) showed potent antibacterial activities against Gram-positive bacteria. Especially, LQM-A exhibited the most significant inhibitory activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), with a low incidence of resistance. An in vivo dual-reporter assay designed to distinguish between compounds that inhibit translation and those that induce DNA damage was employed to assess the mode of action of LQM-A. Consequently, LQM-A-induced DNA damage via DNA intercalation, which was verified by reduced fluorescence based on the ethidium bromide displacement assay. Moreover, LQM-A dramatically reduced expression of grlA and grlB encoding topoisomerase Ⅳ in MRSA. These data suggest that LQM-A exhibited promising antibacterial activity based on the intercalation into double-stranded DNA and transcriptional inhibition of essential genes. The second part of this research describes structure elucidation of alkaloid-type compounds and confirmation of significant inhibitory activity against isocitrate lyase (ICL). ICL, a key enzyme of glyoxylate cycle, plays an important role in the infection and pathogenesis of microorganisms. Based on the spectroscopic data, two compounds were identified and named as bacillimide (5) and bacillapyrrole (6). Absolute configuration (3R, 6S, 7S) of novel compound, bacillimide was determined through NOESY and ECD measurements with benzoyl bacillimide. The bacillimide and bacillapyrrole exhibited significant (IC50 = 44.24 μM) and moderate (IC50 = 190.45 μM) ICL inhibitory activity, respectively. The kinetics assay showed bacillimide behaved as a mixed type inhibitor. The growth phenotype assay using icl-deletion mutant showed that bacillimide inhibited the growth of Candida albicans under C2 carbon utilizing condition. Moreover, bacillimide resulted in dramatically reduced expression of icl gene encoding ICL.

Actinobacteria는 우수한 생리 활성을 가지는 2차 대사물질을 생산하는 매력적인 미생물이다. 해양 환경은 낮은 산소농도, 적은 양의 빛 그리고 높은 압력 등과 같은 독특한 환경적 요소들을 가지고 있다. 이 때문에 해양 유래의 actinobacteria는 새로운 구조와 작용 기전을 가지는 대사물질들의 생산 주체로서 주목받고 있다. 본 연구는 해양 방선균 유래 천연물의 생리활성을 평가하고 그에 대한 작용 기전을 탐색하는 내용을 담고 있다. 첫번째 파트는 분리된 4개의 lactoquinomycin 계열 물질들의 항 세균 효과를 탐색하고 그 작용 기전을 탐색하는 연구를 다루고 있다. Lactoquinomycin A (LQM-A, 물질 1)와 3개의 유사체 (물질 2-4)는 그람 양성 세균에 대해서 우수한 저해능을 보이는 것으로 나타났다. 특히 LQM-A는 대표적인 항생제 저항성 균주인 methicillin-resistant Staphylococcus aureus에 대해서 뛰어난 활성을 보임과 동시에 저항성 균주를 유발하지 않는 것으로 확인되었다. 구조적 유사성을 기반으로 제작된 dual-reporter 실험을 통하여 LQM-A는 번역을 저해하기 보다는 DNA에 손상을 주는 기전을 갖는 것으로 확인되었다. 이는 ethidium bromide displacement 실험을 통하여 LQM-A가 DNA 이중가닥에 끼임으로서 DNA 손상이 유발하는 것으로 나타났다. 또한 LQM-A는 DNA에 끼어들면서 황색 포도상 구균의 필수 유전자인 grlA와 grlB의 발현을 상당히 억제하는 함으로써 항세균 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 두번째 파트는 Candida albicans가 숙주에 감염 시 또는 병원성을 띄는데 있어 필수 효소인 isocitrate lyase (ICL)에 저해 활성을 갖는 물질을 규명하고 저해 활성을 확인하는 연구를 담고 있다. 분광학적 정보를 토대로 분리된 두 물질에 대한 구조를 동정하였고 bacillimide (물질 5)와 bacillapyrrole (물질 6)로 명명하였다. 신규 물질인 bacillimide의 절대 구조 (3R, 6S, 7S)는 NOESY와 ECD 분석을 이용하여 결정하였다. 두 물질은 모두 ICL 효소에 대해서 저해능을 보이는 것으로 확인되었다. 그 중 bacillimide는 ICL 저해제로 알려진 3-nitropropionate에 비해서 활성은 낮지만 매우 뛰어난 활성을 보였으며 Dixon plot을 이용하여 저해 방식을 살펴본 결과 혼합형의 형태를 보이는 것으로 나타났다 (IC50 = 44.24 μM). ICL 발현을 담당하는 유전자(icl)가 삭제된 또는 보완된 돌연변이를 이용한 생장 실험을 통하여 bacillimide는 ICL을 저해함으로써 탄소 2개로 이루어진 영양소의 섭취를 어렵게 하는 것으로 나타났다. 이는 icl의 전사를 억제함으로써 이루어진다는 것을 역전사 중합효소반응을 통해 입증하였다.