The effect of AQP3 on intercellular adhesion in NSCLC A549 cell spheroids through cell protrusions

Abstract

Tumor cell aggregation is critical for cell survival following the loss of extracellular matrix attachment and dissemination. However, the underlying mechanotransduction of clustering solitary tumor cells is poorly understood, especially in non-small cell lung cancers (NSCLC). Here, I examined whether cell surface protrusions played an important role in facilitating the physical contact between floating cells detached from a substrate. I employed poly-2-hydroxyethyl methacrylate-based 3D culture methods to mimic in vivo tumor cell cluster formation. The suprastructural analysis of human NSCLC A549 cell spheroids showed that finger-like protrusions clung together via the actin cytoskeleton. Time-lapse holotomography demonstrated that the finger-like protrusions of free-floating cells in 3D culture displayed exploratory coalescence. Global gene expression analysis demonstrated that the genes in the organic hydroxyl transport were particularly enriched in the A549 cell spheroids. Particularly, the knockdown of the water channel aquaporin 3 gene (AQP3) impaired multicellular aggregate formation in 3D culture through the rearrangement of the actomyosin cytoskeleton. Moreover, the cells with reduced levels of AQP3 decreased their transmigration. Overall, these data indicate that cell detachment-upregulated AQP3 contributes to cell surface protrusions through actomyosin cytoskeleton remodeling, causing the aggressive aggregation of free-floating cells dependent on the property of the substratum and collective metastasis.

종양 세포 응집은 세포 외 기질에서 분리되어 원발성 암 부위로부터 멀리 떨어진 곳으로 이동하는 전이 과정에서 세포 생존율에 중요한 영향을 미친다. 그러나 기계역학적 관점에서 고형암 세포, 특히 비소세포성 폐암(NSCLC)의 응집에 대한 연구가 드물게 보고되었다. 본 연구는 세포막 돌출물이 세포 기질에서 분리된 부유 세포 사이의 물리적 접촉을 촉진하는데 관여하는 지의 여부를 확인하였다. poly-2-hydroxyethyl methacrylate 기반 3차원 배양 방법은 생체 내 종양 세포 클러스터의 형성을 모사하기 위해 고안되었다. 인간 비소세포성 폐암 세포주 A549 spheroid의 전구조식 분석에서, 손가락 같은 돌출물 구조가 액틴 세포골격을 통해 서로 밀착하였다. 타임랩스 홀로토모그래피는 3차원 배양에서, 부유 세포의 손가락 같은 돌출물 구조들이 서로 탐색하면서 유착하고자 하는 경향을 보였다. 글로벌 유전자 발현 분석 결과를 통해 organic hydroxyl transport 유전자가 A549 spheroid에 특이적으로 과발현함을 증명하였다. 특히, 물 수송 채널로 알려진 아쿠아포린 3 유전자 (AQP3)의 발현을 감소시켰을 때, 3차원 배양 환경에서 다세포 응집체의 형성을 저해하였다. 또한, AQP3가 저발현된 세포에서 트랜스마이그레이션이 감소하였다. 본 연구는 AQP3를 과발현하는 비부착 세포가 액틴 세포 골격 리모델링을 통해 세포막 돌출물 구조를 조절하고, substratum과 collective metastasis의 특성에 따라 비부착 세포의 자발적인 응집을 유발함을 확인하였다. 세포막 돌출물 구조가 암의 침습과 전이에 중요한 역할을 함이 알려졌지만 대다수의 연구가 2차원 배양 조건하에서 이루어짐을 확인하였다. 본 연구는 지지체 비의존 3차원 배양 방법을 이용하여 생체 내 종양 세포 클러스터를 모사하였고 그 결과, AQP3가 세포막 돌출물 구조를 조절하여 다세포 응집체를 이루는 세포 간 물리적 접촉에 관여함으로써 암의 진행에 영향을 미침을 밝혀내었다.