Detection of potential zoonotic viruses in animals and evaluation of antiviral activities of chitosan and nano graphene oxide against coronaviruses

Abstract

최근 신종 및 변종 인수공통 바이러스(zoonotic virus)의 출현으로 전 세계의 공중보건학 위험의 증가와 함께 막대한 경제적 손실을 초래하고 있다. 이들 대부분 바이러스는 동물에서 유래하였으며, 향후 사람에게 질병을 유발할 수 있는 잠재적인 인수공통 바이러스들이 여전히 자연계에 존재하고 있다. 따라서 사람으로의 종간 전파를 초래할 수 있는 동물 바이러스들을 조사하고, 이들 바이러스의 인체 감염 가능성을 선제적으로 평가하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 국내 서식 박쥐와 국내 사육 돼지에서 각각 신종 바이러스를 분리하고, 이들 바이러스가 인수공통 바이러스로서 인체에 잠재적인 위험이 있는지를 평가하기 위하여 유전체 분석 및 계통유전학적 분석을 하였다. 그리고, 이러한 인수공통 바이러스의 전파를 효과적으로 차단·제어할 수 있는 소독제 개발을 위하여 천연물질인 키토산 (chitosan)과 나노그래핀 옥사이드 (nano-graphene oxide, nanoGO)의 코로나바이러스에 대한 소독 효과를 평가하였다 먼저, 2020년 7월부터 9월까지 강원과 경북지역에 서식하고 있는 박쥐 4종 6개체에서 신종 바이러스 분리를 시도하였다. 그 결과 경북 지역에서 서식하고 있는 문둥이박쥐 (Eptesicus serotinus)에서 코로나바이러스를 분리하였으며, 바이러스 분리주 HCQD-2020는 전자현미경 관찰에서 코로나바이러스의 특징적인 형태를 보였다. 또한 계통유전학적 분석 결과 이 바이러스는 알파코로나바이러스에 속하였으며, 그동안 밝혀지지 않은 새로운 종(species)으로 밝혀졌다. 전장유전체 시퀀싱 결과 HCQD-2020의 유전체의 길이는 28,000 bp 이며 총 7개의 Open reading frame (ORF)로 이루어져있었다. 알파코로나바이러스에서 보존된 부위로 알려진 아미노산 영역(region)은 총 7개로서 nonstructural proteins (Nsp) 3, Nsp5, 및 Nsp12~16이다. HCQD-2020과 다른 알파코로나바이러스를 비교 분석한 결과 7개 영역 모두에서 유사도가 International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV)에서 지정하는 intraspecsies cutoff 기준인 90% 이하였다. 또한 전장유전체를 이용한 계통유전학적 분석 결과 HCQD-2020는 알파코로나바이러스에 속하였다. ORF1a, ORF1b 및 4개의 주요 단백질 코딩 유전자 대상으로 topology 분석을 하였으며 ORF1a, ORF1b를 제외한 다른 유전자에서는 다른 종과 유사도가 낮았다. 다른 숙주 감염 가능성을 평가하기 위해 In silico 분석한 결과 우제목 (Artiodactyla)와 양박쥐아목 (Vespertilioniformes) 모두 감염될 수 있으며 이는 HCQD-2020가 종간 전염을 일으킬 수 있는 것으로 예측되었다. 다음으로, 돼지 유래 토크티노바이러스 (Torque teno sus virus, TTSuV)로 인한 국내 사육 돼지에서의 유병률을 조사하고, 돼지에서 유행하고 있는 바이러스와 사람 바이러스 간의 유전적 관련성을 계통유전학적으로 분석하였다. 전국 9개 지방에서 2017~2018년에 걸쳐 총 470 샘플을 수집하였으며 TTSuV1 양성검출률은 16%(38/470)였으며 TTSuV2의 경우 36%(168/470) 였다. TTSuV1 과 TTSuV2 동시 감염 양성검출률은 8%(38/470) 였다. 양성샘플 중 3 종(M117, N86, N116)에 대하여 전장유전체분석을 진행하였고 M117과 N86은 각각 TTSuV1 subtype 1b와 1c에 속하며 N116은 TTSuV2 subtype 2b에 속하였다. 추가적으로 돼지샘플에서 사람에게서 발견되는 TTV genogroup 3을 검출하였다. 총 2개의 종(M265, N119)이 검출되었으며 모두 전장유전체는 3,817 bp 이며 M265는 3개의 ORF(ORF1, ORF2, ORF3)로 N119는 4개의 ORF(ORF1, ORF2-1, ORF2-2, ORF3)으로 구성되어 있었다. 이 종들은 98.4%의 일치율을 보였으며, ORF1 기준으로 다른 TTVs 와 계통유전학적 분석 결과 genogroup3의 subgroup 3c에 속하였다. ORF1, ORF2, ORF3 아미노산 비교분석 결과 분리된 두 스트레인은 다른 TTVs 와 아르기닌 풍부 지역 또는 motif 같은 공통적인 서열이 확인되었다. 이는 돼지에서 발견된 스트레인이 사람에게서 발견된 TTV와 관련성이 있음을 의미한다. 사람과 동물에서 공중보건학적 및 경제적 피해를 초래하는 코로나바이러스들에 대한 소독제 연구가 활발히 이루어지고 있다. 본 연구에서는 천연물질인 키토산과 나노그래핀 옥사이드가 코로나바이러스에 대한 항바이러스 효능이 있는지를 in vitro cell culture 시스템을 이용하여 경수 희석액 과 유기물 희석액 조건에서 평가하였다. 키토산의 경우 porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)를, nanoGO의 경우 PEDV, bovine corona virus (BCoV), 및 SARS-CoV-2를 사용하여 항바이러스 효능을 평가하였다. 키토산은 1% 수용액으로 100~800배수 희석농도로 30분간 처리하였을 때 경수 희석액 조건에서 150배 희석배수까지, 유기물 희석액 조건에서는 100배 희석배수까지 PEDV 감염 역가 (infectious titer)가 control 바이러스에 비해 104 이상이 감소하였다. 나노그래핀 옥사이드는 1% 수용액으로 50~800배수 희석농도로 30분간 처리하였을 때 유기물 희석액 조건에서는 100배 희석 배수까지 PEDV와 BCoV 감염 역가가 대조군 보다 104 이상이 감소하였다. 키토산과 나노그래핀 옥사이드는 실험한 모든 희석농도에서 세포독성을 보이지 않았다. Immunofluorescence assay (IFA) 결과에서는 키토산이 경수 희석액 조건에서는 50배 희석배수, 유기물 희석액 조건에서는 1배 희석배수까지 PEDV의 감염 억제하였으며, 나노그래핀 옥사이드는 유기물 희석액 조건에서 50배 희석배수까지 PEDV 및 BCoV의 감염을 억제하였다. 또한 나노그래핀은 중화 실험에서 8배 희석배수까지 SARS-CoV-2를 억제하는 것을 확인하였다. 결론적으로 키토산과 나노그래핀 옥사이드는 코로나바이러스에 대하여 유의미한 제어 효과가 있으며 또한 세포독성을 나타내지 않았다. 이상의 결과를 종합할때, 야생동물 및 주요 산업동물에서 코로나바이러스 및 토크티노바이러스와 같은 인수공통전염병 유발 바이러스들이 존재하고 있어 이에 대한 지속적인 감시 및 연구가 필요하고, 이들 바이러스의 전파 및 감염병 발병을 최소화할 수 있는 신규제어물질에 대한 지속적인 연구 또한 필요하다고 판단된다.

Emerging zoonotic diseases have the potential to cause serious human health problems and economic losses. While some zoonotic diseases, such as avian influenza and rabies, have been well investigated, the occurrence and prevalence of newly emerged viral pathogens in livestock and wildlife reservoir species is not well known. Thus, in this study, potential zoonotic viruses in bats and pigs were isolated and genetically analyzed to evaluate the risk of cross-species transmission to humans. The viral isolate from Eptesicus serotinus, HCQD-2020 strain, was subjected to next-generation sequencing and bioinformatic analyses. Sequence annotation results indicated that this strain contains seven common open reading frames (ORFs) in the typical order 5- UTR-ORF1ab-S-ORF3-E-M-N-ORF7-3-UTR. The comparison of the whole-genome sequence and the conserved amino acid sequence of replicated proteins also revealed that the new strain was distantly related with other known species in the alphacoronavirus genus. Additionally, phylogenetic and in silico prediction analyses suggested that this novel species of alphacoronavirus strain is capable of cross-species infection, especially in the order Artiodactyla. To investigate the prevalence of Torque teno sus virus (TTSuV) in livestock animals, TTSuVs were isolated from pigs with respiratory problems (n = 470). Phylogenetic analyses of these viruses were conducted to evaluate the cross-species transmission of the viruses. In total, positive rates of 16% (75/470) and 36% (168/470) were detected for TTSuV1 and TTSuV2, respectively. Thirty-eight (8%) of the 470 pigs were detected as co-infections of TTSuV1 and TTSuV2. Whole genome sequencing analyses revealed that two strains, M117 and N86, belong to subtype 1b and 1c of TTSuV1 and the N116 strain was located in subtype 2b. Furthermore, two field strains, M256 and N119 were determined to be within genogroup 3 of subgroup 3c, which contains highly conserved ORFs of Anelloviruses. Development of effective disinfectants against zoonotic pathogens is one of the most urgent prerequisites for prevention of transmission and outbreak of zoonoses. Therefore, the antiviral effects of two natural substances, chitosan and nano-graphene oxide (nanoGO), against coronaviruses were evaluated. When 1% chitosan solution was used at a 100-800-fold dilution concentration, the porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) titer decreased over 4 log10 TCID50//mL compared to the control virus. Similarly, 1% nanoGO solution with 500-800 fold dilution concentration effectively reduced PEDV and BCoV infection titers over 4 log10 TCID50//mL compared to the control groups. Cytotoxicity of chitosan and nanoGO was not observed in Vero cell lines at all concentrations tested, suggesting that chitosan and nanoGO have strong antiviral activities against coronaviruses without cytotoxic effect. Although future studies of cytotoxicity in other cell lines are required, chitosan and nanoGO are safe ingredients for use as non-toxic disinfectants against zoonotic viral diseases such as coronaviruses. Furthermore, continuous surveillance of novel zoonotic viral pathogens in wildlife and livestock animals along with the development of an effective decontamination strategy should be maintained to respond to crises caused by zoonotic pathogens.