Effects of 4-Hexylresorcinol on Mandibular Growth in Rats by Histone Deacetylase Inhibition

Abstract

Objective: Histone deacetylase (HDAC) is known to affect bone formation and resorption by deacetylating non–histone proteins such as transcription factors. Therefore, there have been many attempts to utilize histone deacetylase inhibitor (HDACi) to treat bone–related diseases. 4-Hexylresorcinol (4HR) has been studied for a long time as a food additive for anti-browning effect in shrimp and fruits, and was discovered to have anti-inflammatory and anti-microbial effects. Recently it was suggested to have an effect of Class I histone deacetylase inhibitor (HDACi). Therefore, the objective of this study was to evaluate the followings: (1) whether 4HR inhibited the activity of HDACs in Saos-2 cells, and (2) the effects of 4HR application on mandibular growth in rats.

Methods: In vitro study, cultured Saos-2 cells were treated with either 4HR (1, 10, 100 µM) or solvent only. Cellular lysates were collected after 2, 8 or 24 hours using protein lysis buffer. Collected lysates were used for western blotting of HDAC1, HDAC3, HDAC4, HDAC5, Ac-lys, H3, and Ac-H3. To assess the activity of Class I HDAC, inhibitory assay was used. The expression level of ATP, MMP, and oxygen consumption in Saos-2 cells was also measured with assay kits. In vivo study, total 30 of 4 weeks-old Sprague-Dawley rats (15 males and 15 females) were divided into four groups. Control female (n=5) and control male (n=5) groups received only solvent, and experimental male (n=10) and experimental female (n=10) groups received 12.8mg/kg of 4HR into the sublingual area via subcutaneous injection every week. Body weight was also recorded weekly basis. After 12 weeks from the first administration, rats were euthanized and serum and craniofacial head samples were collected. Serum was analyzed for immunoprecipitation high-performance liquid chromatography (IP-HPLC) to assess the expression of growth factors, hormones and osteogenesis-related proteins in each group. Micro-computerized tomography images of rat skulls were used for anthropometric measurements and the independent samples t test was performed to evaluate if there was a statistically significant difference between groups.

Results: 1) The 4HR administration reduced the activity of Class I HDAC & Class IIa HDAC (HDAC4, HDAC5) significantly in Saos-2 cells (p < 0.05). 2) In the animal experiments, 4HR received rats showed different results according to male and female. Male rats in the 4HR group showed significantly smaller mandibular size with decreased testosterone level and body weight than those of male rats in the control group (p < 0.05). In addition, female rats in the 4HR group showed larger mandibular size with elevated growth hormone levels than that of female rats in the control group (p < 0.05).

Conclusions: 4HR exhibited HDACi activity in Saos-2 cells and resulted in different changes in body weight and mandibular size between sexes in growing rats. These findings indicated a possibility that 4HR could be a therapeutic target agent for the regulation of mandibular development in orthodontic patients. However, further studies required to understand the detailed mechanism of how 4HR affected on mandibular growth as an HDACi.

1. 목 적 히스톤 탈아세틸화 효소는 후생유전적 변화의 주요 기전인 히스톤 변형에 관여하며, 히스톤 단백질뿐 아니라 전사요소와 같은 비히스톤 단백질에서도 탈아세틸화를 일으켜 골 형성의 분화 및 개조에 관여한다고 알려져 있다. 따라서 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제를 이용하여 골 관련 질환을 치료해보고자 하는 시도들이 있어왔다. 4-Hexylresorcinol(4HR)은 과일과 해물의 갈변을 방지하는 식품 첨가물로 오랜 기간 연구되면서 항균, 항염 효과를 비롯한 다양한 효과가 보고되고 있다. 최근 연구에서 4HR이 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제의 역할을 할 수 있는 가능성이 밝혀졌다. 따라서, 본 연구의 목적은 (1) 4HR이 Saos-2 세포에서 히스톤 탈아세틸화 효소를 억제하는 작용이 있는지 알아보고, (2) 4HR의 투여가 흰 쥐의 악골의 발육에 미치는 영향을 평가하는 것이었다.

2. 방 법 생체 외 실험을 위하여 Saos-2 세포를 배양 후, 실험군에는 4HR (1, 10, 100 µM) 을 처리하고 대조군은 용매로 처리하였다. 각 2, 8, 24시간 후. 배양된 세포들을 단백질 용해 버퍼액으로 처리한 후에 HDAC1, HDAC3, HDAC4, HDAC5, Ac-lys, H3 및 Ac-H3에 대해 western blot을 시행하여 단백질 발현 정도를 평가하였다. 이외에 시판 키트를 이용하여4HR 투여에 따른 Class I HDAC의 활성도 변화와 ATP, MMP, 산소소비량(oxygen consumption)의 발현 수준의 변화를 계측하였다. 생체 내 실험을 위하여 생후 4주의 암컷 15마리, 수컷 15마리 총 30마리의 흰 쥐(Sprague-Dawley)를 4개의 군으로 분류하였다. 암컷 대조군(n=5)과 수컷 대조군(n=5)에는 용매를, 암컷 실험군(n=10)과 수컷 실험군(n=10)에는 12.8 mg/kg의 4HR을 설하부위(sublingual area)에 매주 피하주사 하였다. 체중 변화도 매주 측정하였다. 12주가 경과된 상태에서 안락사한 다음, 혈액과 머리를 채취하였다. 실험군과 대조군의 혈장을 이용하여 성장 관련 호르몬과 골분화 과정에 연관된 단백질의 면역침강 액체크로마토그래프(immunoprecipitation high-performance liquid chromatograph: IP-HPLC)를 시행하여 발현수준을 측정하였다. 실험군과 대조군의 머리를 마이크로 CT 영상을 이용하여 악골의 길이 측정을 시행한 후 암컷과 수컷의 각 실험군과 대조군에서 통계적으로 유의성 있는 차이가 있는지 독립표본 t검정을 이용하여 평가하였다.

3. 결 과 1) 4HR을 처리한 Saos-2세포에서 Class I HDAC와 Class IIa HDAC (HDAC4, 5)의 활성이 유의하게 억제되었다(p < 0.05). 2) 동물실험에서 발육중인 흰 쥐에 4HR을 투여한 결과 암컷과 수컷 간에 상이한 결과가 나타났는데, 수컷 실험군은 수컷 대조군에 비해 혈중 테스토스테론 농도와 체중이 유의하게 감소되었으며(p < 0.05), 하악골의 크기도 통계적으로 유의하게 작게 나타났다(p < 0.05). 반면, 암컷 실험군과 대조군은 체중의 차이가 없었고 오히려 실험군에서 하악골의 길이가 증가되었다(p < 0.05).

4. 결 론 4HR은 Saos-2 세포에서 히스톤 탈아세틸화효소 활동을 감소시키는 억제제 역할을 하는 것이 관찰되었으며, 실험군에서 성별에 따라 하악골 성장에 상이한 영향을 주는 것으로 나타났다. 이번 연구 결과는 4HR이 교정 영역에서 하악골 성장 조절에 이용될 수 있는 가능성을 제시하였으나, 4HR이 HDACi로서 하악골 발육에 어떻게 관여하는지에 관한 상세한 기전은 향후 연구되어야 할 필요가 있다.