간 섬유화 및 재생과정에서 system Xc 의 역할

Abstract

혈중 pH 조건에서 시스테인(cysteine)은 시스틴(cystine) 이온 형태로 존재한다. System Xc는 이러한 시스틴을 세포 내로 유입시키고 세포 내 글루타메이트를 세포 밖으로 배출하는 아미노산 수송체이다. System Xc를 통하여 세포 내로 이동한 시스틴은 시스테인으로 전환되어 세포 내 항산화 과정 및 세포성장에 필수적인 글루타치온(glutathione)의 합성에 사용된다. System Xc는 빠르게 자라나는 암세포의 산화적 스트레스를 조절하는데 중요한 역할을 하기 때문에 system Xc를 억제하는 다수의 약물들이 항암제로 보고된 바 있다. 본 연구자는 system Xc를 통해 세포 내로 유입되는 시스틴이 증식하는 정상세포에서도 중요하다는 가정 하에 간 전구세포(liver progenitor cell), 간암세포 및 간의 비실질세포에서의 system Xc 역할을 연구하였다. 분화가 완료된 간세포는 더 이상 분열하지 않으며, 메티오닌을 시스테인으로 전환하는 황 전환경로가 잘 발달되어 있어 system Xc를 통한 시스틴의 유입에 대해 의존도가 낮다. 하지만 심각한 급성 간 손상 시에 나타나는 수복과정에서는 간 전구세포가 활발히 분열하고, 만성 간 손상 시에는 대식세포와 간 성상세포를 포함하는 비실질세포가 간에서 분화 및 증식하게 된다. 본 연구에서는 급성 및 만성적 손상을 입은 간에서 간을 구성하는 세포들의 산화적 스트레스 조절기전에서 system Xc의 역할을 구명하였다. 위장관암에서 system Xc가 암 줄기세포 지표로 알려진 CD (cluster of differentiation) 44와 결합하여 세포 내 시스테인 공급에 중요한 역할을 한다고 보고되었다. CD44는 히알루론산(hyaluronic acid)을 포함한 세포 외 기질에 결합하는 막 단백질로 임상적으로 급성 간염이나 간염바이러스 감염을 포함하는 손상된 간 조직에서 발현이 증가한다고 관찰되었다. 간은 심각한 급성 손상 후 간 전구세포를 이용한 재생 과정을 통하여 그 기능을 회복한다. 간 전구세포는 분화된 간세포와는 다르게 증식할 수 있으며, CD44를 포함하는 줄기세포 지표들을 발현한다. 본 연구자는 재생하는 간 세포를 이용하여 세포 손상 시 CD44를 매개로 한 system Xc의 활성 증가를 급성 간 손상 모델에서 입증하고, 이에 대한 분자적 기전을 구명하고자 하였다. 간 전구세포에서 높게 발현되는 CD44는 세포막에서 system Xc의 구성요소인 xCT 단백질을 안정화시켜 세포 내 시스테인 공급을 증가시켰다. 증식하는 정상 간 세포주에서 CD44를 결손시킬 경우, 세포 내 GSH가 감소하고 산화적 스트레스가 증가하였으며, 간세포의 성장속도가 감소하였다. 한편 간 전구세포에서 CD44가 세포의 system Xc에 대한 의존도를 증가시킨다는 연구결과를 바탕으로, 간암세포의 CD44 발현 수준을 이용하여 항암 후보물질로 활발히 연구되고 있는 system Xc 억제제에 대한 반응성을 예측할 수 있다는 사실을 확인하였다. System Xc 가 억제되면 세포 내 시스테인이 고갈되고, 이에 따라 세포 내 축적된 활성산소는 지질 과산화를 동반하는 페로토시스(ferroptosis)를 유발한다. 다양한 간 유래 세포를 이용하여 CD44의 발현과 system Xc 억제제를 처리하였을 때 페로토시스가 일어나는 정도를 비교분석 하였다. 이를 통하여 간 유래 세포에서 CD44의 발현이 system Xc 억제에 대한 반응성을 예측할 수 있는 지표임을 확인하였다. 만성적으로 간이 손상되는 경우에는 간에서 성상세포와 대식세포가 활성화 되고 증식한다. 본 연구에서는 간 섬유화 전단계인 간염 환자의 간 조직에서 system Xc의 구성요소인 xCT 단백질 발현이 높다는 점을 확인하였다. 따라서 간 섬유화 모델에서는 비실질세포에서 system Xc억제약물의 간 섬유화 치료제로서의 가능성을 연구하였다. System Xc의 기능을 차단하기 위해 미국 FDA (US Food and Drug Administration) 에서 류마티스 치료제로 승인한 오라노핀(auranofin)을 사용하였다. 오라노핀은 저농도에서부터 system Xc의 기능을 억제하였다. NLRP3 인플라마좀(inflammasome)은 NLRP3 (NOD-, LRR- and pyrin domain-containing protein 3), ASC (associated speck-like protein containing a CARD) 와 procaspase-1으로 이루어진 다량체 단백질 복합체로서, 인터루킨(Interleukin-) 1β를 포함한 염증성 사이토카인(cytokine) 분비와 염증 형태의 세포사멸과정인 pyroptosis를 매개한다. NLRP3 인플라마좀의 활성은 간에서 섬유화 진행을 매개한다고 보고되었다. 간 섬유화 진행에서 system Xc를 차단하였을 때 비실질세포에서 특이적으로 발생하는 활성산소 생성은 NLRP3 인플라마좀의 활성을 감소시켰다. 오라노핀은 인플라마좀 활성을 억제하여 대식세포의 염증성 사이토카인 분비, 염증성 세포사멸과 간 성상세포의 이동능을 감소시켰다. 반면, 오라노핀은 세포 내 기저 GSH 수준이 높은 간세포에서는 산화적 스트레스를 유발하지 않았다. 오라노핀의 간 섬유화 억제효과를 티오아세트아미드(thioacetamide)에 의해 유도된 간 섬유화 모델에서 확인하였다. 또한 본 연구에서 확인한 기전을 바탕으로 오라노핀의 간 섬유화 억제효과를 매개하는 활성대사체로서 aurocyanide를 규명하였다. 본 연구결과를 종합하면, 간에서 증식하는 세포들은 system Xc를 통해 유입된 시스틴에 대한 의존도가 높다. 세포 내로 유입된 시스틴은 시스테인으로 환원되어 세포의 산화적 스트레스를 조절하고, 세포 증식에도 관여한다. 본 연구는 병리상황에서 증식이 활발한 간 전구세포, 간암세포 및 간의 비실질세포에서 system Xc의 역할을 구명하는데 초점을 맞추었다. 그 결과로서 간 전구세포에서는 CD44의 발현증가가 system Xc 활성증가를 매개한다는 사실을 밝혔다. 이를 바탕으로 간암세포에서는 system Xc 억제제에 대한 민감도를 예측하기 위한 지표로서 CD44의 활용가능성을 제시하였다. 또한 간 섬유화 시 활성화되고 증가하는 대식세포 및 간 성상세포에 있어서 system Xc 억제제인 오라노핀이 섬유화를 개선할 수 있다는 사실을 확인하였다. 본 연구에서 구명한 새로운 약리기전을 통해 오라노핀의 간 섬유화에 대한 약물로의 신약 재창출(drug repositioning)을 기대할 수 있다. 실제로 위의 실험결과들을 바탕으로 하여 오라노핀은 간 섬유화를 동반한 비알콜성지방간염의 치료제로 IND (Investigational New Drug) 승인 및 임상2상의 진행단계에 있다. 또한 이러한 약리기전을 바탕으로 오라노핀의 인체 내 활성대사체로서 aurocyanide를 지정하였다. Aurocyanide는 구조가 단순하여 신약전구물질로의 사용은 어려울 것으로 예상되지만 오라노핀의 효과를 예측하는 지표로서 추후 활용이 기대된다. 하지만 본 연구결과에 따르면 system Xc의 억제가 간 전구세포에 미치는 영향을 고려하였을 때, 간의 재생과정이 회복에 중요한 간 질환에 있어서는 오라노핀을 포함한 system Xc 억제제의 사용이 제한될 수 있다는 점도 보여준다. 그러므로 기존에 보고된 간 질환들의 병리기전과 본 연구에서 규명한 system Xc의 역할을 바탕으로, 향후 간 질환의 치료표적으로서 system Xc를 활용할 수 있을 것으로 예측된다.

System Xc is an amino acid antiporter composed of a light chain, xCT, and a heavy chain, 4F2hc. It transports the anionic form of extracellular cystine for intracellular glutamate. The imported cystine is reduced to cysteine and subsequently assembles with glutamate and glycine to form glutathione (GSH). In differentiated hepatocytes, most of the intracellular cysteine is synthesized from methionine through the transsulfuration pathway. However, most of the proliferating hepatic cells lack the transsulfuration pathway. They are highly dependent on the system Xc-mediated cystine influx. Proliferating hepatic cells including liver progenitor cells (LPCs), hepatocellular carcinomas, and nonparenchymal cells express a high level of xCT. In this study, we focus on identifying the role and regulation mechanism of the system Xc in these proliferating hepatic cells. For the first part of the study, we identified the regulation mechanism of system Xc activity after acute liver injury. Liver regeneration triggered by fulminant liver damage accompanies the proliferation of LPCs. CD44 is one of the proposed LPC markers for distinguishing the subpopulation of hepatocytes that can clonally proliferate. In a gastric cancer cell, Ishimoto et al. reported that CD44 supports cysteine metabolism by stabilizing xCT. We hypothesized that this role of CD44 is also relevant in the context of LPCs, which require efficient cysteine supply for cell proliferation. After liver resection or exposure to acetaminophen, the CD44 expression level was elevated in mouse primary hepatocytes isolated from regenerative liver tissues. Flow cytometry data identified LPCs, a subpopulation of hepatocytes with a high CD44 expression level and proliferation rate. To elucidate the role of CD44 in LPC proliferation, we knocked it down in AML12 cells. Knockdown of CD44 decreased the expression of xCT as well as the uptake of extracellular cystine through system Xc. CD44 ablation resulted in a diminished intracellular cysteine, glutathione (GSH), and a decreased proliferation rate. The proliferation of LPC isolated on a hyaluronic acid-coated dish was highly sensitive to inhibition of system Xc. Administration of system Xc inhibitor abrogated liver regeneration after acetaminophen (N-acetyl-p-aminophenol; APAP)-induced liver injury. Moreover, liver regeneration following APAP injection was significantly inhibited in hepatocyte-specific CD44 knockdown mice. The obtained results delineate the central role of CD44 in modulating liver-regenerative capacity. Specifically, CD44 contributes to the intracellular redox balance and cell proliferation by enhancing extracellular cystine uptake through system Xc. In addition, we could confirm the correlation between CD44 expression level and sensitivity to erastin-induced ferroptosis in hepatocellular carcinomas. Ferroptosis is an iron-dependent cell death that is induced by system Xc inhibition. CD44-expressing hepatocellular carcinomas lacked the enzymes critical for the transsulfuration pathway (CBS or CSE). Consequently, they were highly sensitive to the treatment of erastin. Based on this finding, we proposed CD44 as a biomarker for ferroptosis sensitivity in hepatocellular carcinomas. For the last part of the study, we identified the role of system Xc in nonparenchymal cells. Unlike the acute liver injury, LPCs rarely participate in the progression of liver fibrosis. Instead, macrophages and hepatic stellate cells (HSCs) mainly engage in the disease progression; liver fibrosis progresses following multi-hit processes involving activation and proliferation of hepatic stellate cells and macrophages. Because these nonparenchymal cells highly express CD44 and xCT, we could estimate that blockade of system Xc may inhibit liver fibrosis. We assessed the effect of system Xc inhibition on liver fibrosis by using auranofin. Auranofin is an oral anti-rheumatic agent that is approved by FDA. In this study, we found that auranofin inhibits system Xc activity, thereby depleting intracellular GSH and inducing oxidative burst. The instant oxidative stress-mediated anti-fibrotic effects in both macrophages and HSCs. Auranofin potently inhibited activation of the NLRP3 inflammasome in bone marrow-derived macrophages and Kupffer cells. It also reduced the migratory ability of HSC. Auranofin significantly inhibited thioacetamide-induced liver fibrosis. Taken together, to the best of our knowledge, we propose the use of auranofin as an anti-liver fibrotic agent. It should, however, be noted that system Xc plays a central role in the self-renewal capacities of the liver. The importance of nonparenchymal cells activation and LPC proliferation in disease progression should be thoroughly concerned before the use of auranofin on liver injuries other than liver fibrosis.