대식세포 표적화 및 분극화를 위한 보리 베타글루칸/ CpG 올리고뉴클레오타이드/ 은나노입자 복합체

Abstract

본 연구에서는 면역 보조제로 사용되고 있는 CpG 올리고뉴클레오타이드(Unmethylated cytosine-phosphate-guanine, CpG ODN)와 면역 원성이 있어 다양한 면역 질환의 치료에 활용되고 있는 보리 베타글루칸을 전달할 수 있는 보리 베타글루칸/CpG 올리고뉴클레오타이드/은나노입자 삼중 복합체를 개발하여 대식세포에 대한 뛰어난 친화성과 M1 표현형으로의 분극화 효과를 확인하였다. 산화 베타글루칸(Ox-β-glucan)의 수평균 분자량과 중량 평균 분자량은 OXBG 0.5X가 각각 4.2 kDa, 22.9 kDa였으며, 1X가 3.0 kDa, 13.9 kDa, 2X가 2.0 kDa, 9.2 kDa로 나타났다. 또, OXBG의 알데히드기는 0.5X가 1.07 mmole/g, 1X가 2.39 mmole/g, 2X가 3.81 mmole/g으로, 각각 14.14, 31.66, 50.35%의 산화도를 갖는 것으로 계산되었다. 베타글루칸의 산화도와 분자량은 제조된 나노입자의 안정성과 대식세포에 대한 친화도에 영향을 미쳐, βG1X-CpG-Ag NP는 낮은 안정성을 보였다. 은나노입자의 크기와 형태는 Ag 이온을 방출할 수 있는 표면적의 넓이를 결정하여, 작은 크기일수록 더 많은 활성산소종을 유도하며 높은 세포 독성을 갖는다. Ag NP와 CpG-Ag NP는 가장 고농도에서도 각각 80%와 90% 이상의 세포 활성을 가졌으며, βG0.5X-CpG-Ag NP 또한 가장 높은 농도를 처리했을 때를 제외하고 80% 이상의 세포 활성을 보였다. Ag가 노출되지 않은 CpG-Ag NP와 βG0.5X-CpG-Ag NP는 세포 내에서 표면이 노출된 Ag NP만큼의 활성 산소종을 발생시키기까지 더 많은 시간이 필요하였다. βG0.5X-CpG-Ag NP를 처리했을 때, 4시간이 경과해서는 DCF 형광이 증가하지 않았다. 그러나 8시간이 경과했을 때는 세포 대비 1.74배까지 형광 세기가 증가하여 1.88배 증가한 Ag NP와 유사한 수준을 보였다. 유세포 분석 실험에서 베타 글루칸을 포함하는 나노 입자의 암세포인 HeLa 세포 대비 면역세포인 RAW264.7 세포에 대한 높은 친화도를 확인할 수 있었으며, 특히 RAW264.7 세포에서 βG0.5X-CpG-Ag NP의 세포 투과율이 85.0%로 CpG-Ag NP의 33.9%에 비해 월등히 높았다. Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR)에서는 M1 분극화에 대한 지표로 iNOS, COX-2의 발현 수준을 보았을 때, RAW264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 발현 수준이 증가하였으며, 특히 COX-2가 βG0.5X-CpG-Ag NP를 처리했을 때 CpG-Ag NP보다 통계적으로 유의한 수준으로 증가하였다. 본 연구에서는 베타글루칸을 활용하여 대식세포에 대한 높은 친화도를 갖는 삼중 나노 입자를 제작하였으며, 이를 이용하여 대식세포의 M1 분극화 가능성을 확인하였다.

In this study, a triple nanocomplex of barley beta glucan/CpG oligonucleotide/silver nanoparticles that can deliver CpG oligonucleotide used as an immunosuppressive agent and barley beta glucan used to treat various immune diseases was developed, confirming its high affinity to RAW264.7 cells and polarization effect into M1 phenotype. The number average molecular weight of oxidized beta glucan, OXBG 0.5X, 1X, 2X was 4.2 kDa, 3.0 kDa, 2.0 kDa, respectively. Their weight average molecular weight was 22.9 kDa, 13.9 kDa, 9.2 kDa, respectively. In addition, measured aldehyde in OXBG 0.5X, 1X, 2X was 1.07 mmole/g, 2.39 mmole/g, 3.81 mmole/g, with a calculated oxidation degree of 14.14, 31.66 and 50.35%, respectively. The oxidation degree and molecular weight of beta glucan affected stability of the prepared nanoparticles, and βG1X-CpG-Ag NP showed aggregation in serum-free media after 4h incubation at 37℃. The size and shape of the silver nanoparticles determine surface area capable of releasing silver ions, thus the smaller the size, the more reactive oxygen species are induced and has higher cytotoxicity. All particles showed no cytotoxicity, except when highest concentration was treated. CpG-Ag NP and βG0.5X-CpG-Ag NP with modified surface took more time to produce reactive oxygen species compared to Ag NP with exposed surfaces. When βG0.5X-CpG-Ag NP was treated, DCF fluorescence did not increase after 4 h incubation. However, it increased up to 1.74 times after 8 h incubation compared to non-treated cells, which is similar level compared to Ag NP. Through flow cytometry experiment, higher affinity for RAW264.7 cells, compared to HeLa cells, of nanoparticles containing beta glucan was confirmed. RAW264.7 cells treated with βG0.5X-CpG-Ag NP showed uptake efficiency of 85.0%, which was much higher than 33.9% of CpG-Ag NP. In qPCR experiment, expression levels of M1 polarization markers (iNOS, COX-2) increased in RAW264.7 cells treated with CpG-Ag NP and βG0.5X-CpG-Ag NP after 24 h incubation. Also, βG0.5X-CpG-Ag NP induced increased expression of COX-2, which was statistically greater than the result of CpG-Ag NP. In conclusion, triple nanocomplex including beta glucan showed high affinity towards RAW264.7 cells and showed potential in M1 polarization of macrophages.