Flavor enhancement by developing CRISPR-Cas9 technology in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Saccharomyces cerevisiae is used worldwide to produce ethanol and various by-products. Particular aroma compounds are the desired group of secondary metabolites produced by S. cerevisiae. In a previous study, an interesting result was accidentally discovered, which has the improvement of tropical and rosy flavors in mutants after the CRISPR-Cas9 system without other side effects. Previous strains, applied CRISPR system, indicated that both deletion and disruption of CAR1 gene result in improved specific flavor production.. Here, the hypothesis is tested by inactivating the CAR1 gene of another S. cerevisiae species using CRISPR-Cas9 genome editing. Additionally, in this research, the CRISPR-Cas9 system was built to establish sgRNA synthesis in vitro without foreign plasmid. And it could make non-sense mutation and complete mutation of the target gene, the CAR1 in SNUws strain. All of the SNUws mutants create equally improved production of specific flavors than wild type including other strain types such as SNUit strain and KCCM 51299 strain using by GC-MS analysis. As expected, results explained an increase in the relative abundance of aroma compounds such as isoamyl alcohol and phenethyl alcohol in modified the microbes with development of the CRISPR-Cas9 system. The connection from the inactivation of the CAR1 gene to both isoamyl alcohol like tropical fruit flavor and phenethyl alcohol like rose flavor is unknown. This study shows that although it is not clear that the arginase concentration of the gene affects the flavor pathways until now, there is a specific link. Therefore, more research is needed in the future. And yeast's unique volatile compounds will provide important information to making natural additives in modern the fragrance industries.

세계적으로 효모는 인간에게 유용한 에탄올과 다양한 부산물들을 생산하는 데 사용돼 왔다. 특히 효모가 생산하는 2차 대사산물 중 하나로 향미 그룹이 있다. 현대사회에서 소비자들은 다양한 향미 관련 시장에 높은 관심을 보이고 있으며, 화학합성 보다 친환경을 선호하는 경향을 보였다. 따라서 효모에서 생합성된 향성분은 소비자들을 만족시킬 수 있는 화장품, 향수, 및 케어산업에 이용될 수 있을 것이다. 연구실에서 CRISP-Cas9시스템을 이용해 CAR1 유전자를 불활성화한 논문을 출판한 이후, 만들어진 균주를 분석하던 중 특별한 향이 증가된 경향을 보였다. 바로 트로피칼한 향과 장미향이다. 이전연구는 또한 CAR1 유전자를 다른 서열을 가진 유전자 서열로 불활성화 시켰기 때문에 두 가지의 뮤턴트 타입이 존재한다. 이 두 가지 뮤턴트에서 일관적으로 증가한 두 아로마 화합물의 증가는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용해 특정 향미를 증진할 수 있다는 가설을 세울 수 있게 하였다. 이 연구에서 종특이적 결과인지 가설의결과인지 확인하기 위해 동일한 방식의 CRISPR-Cas9을 이용해 같은 유전자인 CAR1을 다른 효모 종에서 불활성화 시켜 동일한 구축 모델을 형성하였다. 추가로 이 연구에서는 sgRNA를 in vitro로 합성하여 플라스미드를 넣어주지 않는 방식으로 연구를 발전시켰다. 테스트 결과 3가지 이스트 종 모두에서, CAR1 유전자가 유전적으로 다르게 불활성화 된 두 균주에서 트로피컬 향미를 나타내는 Isoamyl alcohol과 장미향미를 나타내는 Phenethyl alcohol이 모두 야생 균주에 비해 증가하는 경향을 GC-MS를 통해 관찰 할 수 있었다. CAR1 유전자와 특정향미인 Isoamyl alchol과 Phenethyl alcohol은 현재까지 아무런 연관관계도 밝혀진 바 없고 보고된 바가 없다. 그러나 일관적인 연구 결과를 바탕으로 CAR1 유전자의 불활성화와 특정 향미의 증가는 연관이 되어있는 것으로 설명할 수 있다. 그러므로 연관관계에 대한 실타래를 풀기 위해 더 많은 연구가 미래에 필요할 것으로 보인다. 그리고 이것은 미래에 자연으로부터 합성된 원료로, 향미 관련 시장에서 중요하게 쓰일 것으로 기대된다.