Development of label-free colorimetric aptasensor based on the aggregation of gold nanoparticles for detection of gliadin in real foods

Abstract

Gluten, composed of glutenin and gliadin, is an important raw material that determines the quality of wheat foods such as bread and pasta by giving dough viscoelasticity. However, gliadin in the gluten protein causes celiac disease and wheat allergens, which causes fatal damage to the small intestine, so many methods have been developed for the detection of gluten. The studied detection method has disadvantages that are difficult to use practically in the field due to complicated equipment, long time, and cost. In this paper, a label-free colorimetric aptasensor detection method that can detect gliadin in gluten, a cause of celiac disease, was developed in the field. Based on the salt-induced aggregation of gold nanoparticles, it was detected using a gli4 aptamer that specifically recognizes gliadin. The pre-treatment process of gliadin was simplified to be suitable for the field by extracting it by dissolving it in 60% ethanol. For induction of salt aggregation of gold nanoparticles, gli4 aptamer, gliadin, and NaCl were each optimized in concentration and volume, as confirmed by UV-Vis spectrophotometer and electron transmission microscope (TEM), NaCl and gli4 aptamer concentrations were optimized to 120 mM and 125 nM, respectively. When detecting gliadin based on optimization, the linear curve range (0-120 mg/L) that meets the gluten-free standard (20 mg/L) within 70 min, and the detection limit is 10.5 mg/L (UV-Vis spectrophotometer) and 12 mg/L (colorimetric). In addition, as a selectivity test, the aptasensor was observed for other grain proteins (barley, oats, corn, and rice), and it was confirmed that it responded only to gliadin. To confirm the detection in real foods, ELISA and aptasensor were compared by spiking gliadin at any concentration into gluten-free foods (pasta, bread, and cookie), and it was shown that it could be detected below the gluten-free standard. Therefore, the results of this study are expected to be applied in the food industry to gluten-sensitive allergen patients and environments that require verification of gluten-free food.

글루테닌과 글리아딘으로 구성된 글루텐은 반죽에 점탄성을 부여하여 빵, 파스타 등 밀 식품의 품질을 결정짓는 중요한 원료이다. 그러나 글루텐 단백질의 글리아딘은 소장에 치명적인 손상을 주는 셀리악 병 및 밀 알러젠을 유발되며, 이를 검출하기 위해 많은 방법들이 개발되었다. 하지만 연구된 검출 방법들은 복잡한 장비, 긴 시간, 비용으로 인해 현장에서 실용적으로 사용되기 어려움이 있다. 본 논문에서는 셀리악 병의 원인이 되는 글루텐에 존재하는 글리아딘을 현장에서 검출이 간편하고 장비가 필요 없이 육안으로 식별이 가능한 라벨 없는 압타센서 검출법을 개발하였다. 금나노입자의 염 유도 응집을 기반으로 글리아딘을 특이적으로 인식하는 gli4 압타머를 활용하였다. 글리아딘의 전처리 과정은 추출하는 과정으로 에탄올 60%에 용해시켜 추출함으로써 현장에 적합하게 간소화했다. 금 나노입자의 염 응집 유도를 위해 gli4 압타머, 글리아딘 및 NaCl은 각각의 농도, 부피를 최적화하여, 분광광도계 및 전자 투과현미경(TEM)을 통해 NaCl 및 gli4 압타머 농도는 각각 120 mM, 125 nM로 선정했다. 최적화를 기반으로 글리아딘 검출시, 70분 이내로 글루텐 프리 기준(20mg/L)에서 선형 구간(0-120 mg/L)과 검출 한계는 각각 10.5 mg/L (분광광도계), 12mg/L(비색)로 검출되었다. 선택성 실험을 통하여 다른 곡물 단백질(귀리, 옥수수, 쌀, 보리)에 대해 관찰하였고 압타센서는 글리아딘에만 반응하는 것을 확인했다. 실제 식품에서의 검출을 확인하기 위해, 글루텐 프리 식품(파스타, 빵, 쿠키)에 글리아딘을 스파이킹하여 ELISA와 압타센서를 비교하였고 글루텐 프리 기준 이하로 정량화할 수 있음을 확인했다. 따라서 본 연구의 결과로 식품산업에서 글루텐에 민감한 알러젠 환자 및 글루텐 프리 식품의 검증이 필요한 환경에 적용이 될 수 있을 것으로 기대된다.