Molecular characterization of Bifidobacterium spp. from Korean infant feces using culturomic approach

Abstract

장내 미생물 균총은 다양한 메커니즘을 통해 인간의 건강과 질병을 조절하는 중요한 역할을 한다. 특히, Bifidobacterium은 혐기성 균주로 다른 프로바이오틱스 균주와 비교하였을 때 다양한 종이 밝혀져 있지는 않지만 유아의 장내에 주로 존재하는 것으로 알려져 있어 다양한 기능의 프로바이오틱스 균주로 많이 사용되고 있다. 프로바이오틱스로서 Bifidobacterium 균주를 개발하기 위해서는 다양한 Bifidobacterium 균주를 분리하고, 프로바이오틱스로서 기능성과 장내 미생물에 미치는 영향을 평가하는 연구가 진행되어야 한다. 따라서 본 연구는 유아 분변에서 다양한 Bifidobacterium 균주를 분리하고 프로바이오틱스로서 균주가 갖는 기능성을 평가하며, 다양한 모델을 활용하여 장내 미생물 균총에 미치는 영향을 확인하였다. Bifidobacterium을 분리하기 위해 모유 수유 기간이 상이한 유아의 분변에서 장내미생물 균총의 구성을 확인하였고, Bifidobacterium의 composition이 상대적으로 우수하였던 12개월 이상 모유 수유한 유아의 분변에서 분리를 진행하였다. 분리된 9개의 후보 균주를 Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF/MS) 분석과 16S ribosomal RNA sequencing을 통해 확인한 결과, Bifidobacterium animalis 3종, Bifidobacterium lognum 2종, 그리고 Bifidobacterium pseudocatenulatum 2종을 분리하였다. 분리된 Bifidobacterium 균주는 계통도 분석과 Scanning electron microscope(SEM)를 통해 계통학적, 형태학적 특성을 확인한 결과 동종 간에는 계통학적 유사성을 가지고 있었으며, Bifidobacterium에 해당하는 rod-type의 형태학적 특성을 보였다. 분리된 모든 Bifidobacterium 균주는 기능성 평가를 진행하여 프로바이오틱스로서 기용성을 확인하였다. 먼저 내산성, 내담즙성을 확인한 결과, 각각 비처리군 대비 약 70%, 80%의 생존율을 보였으며, 특히 내산성에서는 Bifidobacterium animalis B7, 내담즙성에서는 Bifidobacterium longum F5가 가장 높은 생존율을 보였다. 항생제 내성을 확인해보았을 때, kanamycin과 vancomycin, tetracycline을 제외한 모든 항생제에서 Bifidobacterium 균주가 저항성을 보이지 않았으며, tetracycline에서는 Bifidobacterium animalis B7과 Bifidobacterium animalis D2만 저항성을 나타냈다. 항균활성 실험을 진행한 결과, 모든 균주가 병원성 균인 Salmonella typimurium SL1344와 Escherichia coli ATCC 35150를 저해하는 것을 확인하였고, 장부착능을 확인한 결과, Caenorhabditis elegans(C. elegans) 모델에서는 Bifidobacterium animalis C1, D2, 그리고 Bifidobacterium pseudocatenulatum E6이 가장 높은 부착능력을 가지고, HT-29 세포주에서는 Bifidobacterium animalis B7이 대조 균주인 Lactobacillus rhamnosus GG 대비 유의적으로 부착능을 증가시켰다. 마지막으로 C. elegans 모델을 활용하여 Bifidobacterium 균주가 숙주에 긍정적인 효과를 가져오는지 확인해보았을 때, Bifidobacterium animalis C1을 제외한 모든 균주가 Escherichia coli OP50 균주 대비 C. elegans의 수명을 연장시켰고, 병원성 균인 Staphylococcus aureus Newman에 노출된 C. elegans의 수명도 모든 Bifidobacterium 균주가 연장시키는 것을 확인하였다. 기능성 실험을 통해 총 3종의 Bifidobacterium 균주가 프로바이오틱스로서 가능성을 가지고 있음을 확인한 후, 인간의 소화기관을 모사한 시스템인 Fermentation of the intestinal microbiota model(FIMM)을 통해 Bifidobacterium 균주가 장내 미생물 균총에 미치는 영향을 확인하였다. 결과적으로 장내미생물 균총의 유의적인 변화는 나타나지 않았지만 Bifidobacterium animalis D2와 Bifidobacterium longum F5가 lactic acid를 약 300~400mg/L 유의적으로 증가시키는 것을 확인하여 Bifidobacterium의 처리가 대사체의 변화를 가져온다는 것을 확인하였다. 위의 결과를 토대로 유기체 내에서의 변화를 자세히 확인하기 위해 마우스 모델을 활용하여 Bifidobacterium 투여를 통한 효과를 확인하였다. Bifidobacterium 균주를 투여한 결과 Bifidobacterium pseudocatenulatum E6과 Bifidobacterium longum F5 투여군에서 장의 길이가 유의적으로 증가함을 확인하였다. 또한 혈액분석기와 Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 통해 간 손상, 지방 대사, 염증성 사이토카인을 확인해본 결과, 지방 대사와 관련된 인자들에서는 유의적 차이가 나타나지 않았지만 간 손상을 나타내는 alanine amino transferase(ALT)와 aspartate amino transferase(AST)가 항생제를 투여한 그룹에서 증가한 반면 Bifidobacterium을 처리한 모든 그룹에서 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 염증성 사이토카인인 Interleukin 1β(IL-1β)와 Interleukin 6(IL-6)의 수준 또한 Bifidobacterium animalis D2와 Bifidobacterium pseudocatenulatum E6이 항생제 투여 그룹과 비교하여 유의적으로 감소시켰다. 마지막으로 그룹별 대사체 분석과 유전체 분석을 진행하였을 때, 그룹별로 각각 다른 대사 산물을 만들어내는 것을 확인할 수 있었고, 유전체 분석을 통해 항생제를 처리한 그룹에서는 장내 미생물 불균형이 유발되었지만, Bifidobacterium을 처리한 그룹에서는 장내 미생물 군총의 균형이 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 유아 분변에서 분리한 Bifidobacterium 균주는 프로바이오틱스로서 높은 생존율과 부착능을 보이며 C. elegans 숙주의 수명을 연장시킬 뿐 아니라 마우스 모델에서 장 길이를 증가시키고, 염증성 사이토카인을 감소시키는 등 항생제로 유발된 장내 불균형을 완화시키는 것이 확인되어 프로바이오틱스로서 사용되는데 효과적일 것으로 사료된다.

Through a variety of mechanisms, the human gut microbiome plays a crucial role in controlling human health and disease. Bifidobacterium is a probiotic famous for its prevalence in the gastrointestinal tract of infants as well as its beneficial properties. Using the fructose-6-phosphoketolase assay, we were able to isolate 11 Bifidobacterium candidates from fecal samples. Then we used the Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry analysis and 16S rRNA sequencing to confirm them. Finally, Bifidobacterium was identified in seven isolates including B. animalis B7, B. animalis C1, B. animalis D2, B. pseudocatenulatum E6, B. longum E8, B. pseudocatenulatum E9, and B. longum F5. After that, we looked into their ability to work as a probiotic. The ability of Bifidobacterium strains from infant feces was confirmed through acidic and bile tolerance, antibiotic sensitivity, antibacterial activity, adhesion ability, and C. elegans experiments. In the acid tolerance assay, B. animalis C1 and B. animalis D2 had a about 80% survival rate, while B. longum E8, B. pseudocatenulatum E9, and B. longum F5 had a survival rate of more than 80% in the bile tolerance assay. All Bifidobacterium strains were susceptible to ampicillin, chloramphenicol, and penicillin in the antibiotic sensitivity assay, and all isolates were also susceptible to tetracycline except B. animals B7 and B. animals D2. Additionally, adhesion ability assay revealed that B. animalis C1, B. animalis D2, and B. pseudocatenulatum E6 had similar adhesion ability in C. elegans model, and all strains had the potential to inhibit the pathogenic bacteria including S. typhimurium 5L1344 and E. coli ATCC 35153. Finally, it was demonstrated that all Bifidobacterium strains extended the lifespan of C. elegans, moreover, they had a significant impact on the host's immune defense system against pathogenic bacteria such as s. aureus Newman. Therefore, we used the Fermentation of the intestinal microbiota model assay and in vivo experiment to see if Bifidobacterium strains had an effect on gut microbiota. The fermentation of the intestinal microbiota model assay demonstrated that B. animalis D2, B. pseudocatenualtum E6, and B. longum F5 influenced the synthesis of metabolites like lactic acid and acetic acid. In the mouse model, B. animalis D2, B. pseudocatenualtum E6, and B. longum F5 extended intestinal length and significantly decreased levels of inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-α, interleukin-1β, and interleukin-6 by alleviating antibiotic-induced gut microbiota dysbiosis. Finally, we demonstrated that B. animalis D2, B. pseudocatenualtum E6, and B. longum F5 were influenced fecal microbiota, microbial metabolites, and immune regulation.