Alzheimers disease and Niemann-Pick type C disease modeling using human brain organoids

Abstract

알츠하이머와 니만-피크 C1형 질환은 신경 퇴행성 뇌 질환으로 많은 연구가 진행됨에도 불구하고 정확한 메커니즘과 효과적인 치료제가 불명확하다. 많은 제약사가 치료제 개발에 앞장서고 있음에도 불구하고, 현재까지 치료제들은 증상을 완화하고 진행 속도를 늦춰주는 효과만 있을 뿐 증상 자체의 치료 효과는 없다. 이와 같은 실패 원인 중 하나는 인체 생리 현상과 질병의 병리 생태를 모방한 실험적 모델의 부재 때문이다. 그러므로 현재 질환 원인 분석 및 치료제 개발이 직면하고 있는 문제점을 극복하기 위해, 실제 인체 생리 현상 모방이 가능한 새로운 모델을 개발해야 한다. 이를 위해 최근 환자 체세포로부터 유래된 이차원 유도 신경줄기세포 모델을 이용해 연구와 신약 개발을 위한 스크리닝 플랫폼으로 적용되고 있다. 또한 줄기세포의 자가 조직화 능력을 활용하여 인간 실제 뇌를 구조적, 기능적으로 모사할 수 있는 삼차원 구조의 미니 뇌 오가노이드가 개발됨에 따라 질환 모델링과 약물 스크리닝이 활발하게 진행 중이다. 따라서 본 연구는 질환의 병리적 특징과 원인 및 약물 효능 검증을 위해 이차원 유도 신경줄기세포부터 삼차원 뇌 오가노이드까지 질환 연구 플랫폼으로 제시하고자 한다. 본 연구의 첫 번째 장에서는 가족성 알츠하이머 환자 섬유아세포 유래 유도 신경줄기세포를 이용해 알츠하이머 초기 병리에 기여하는 미토콘드리아 기능 저하 표현형 연구를 진행했다. 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 아밀로이드 생성경로에서 생기는 C-terminal fragments (APP-CTFs)의 축적이 미토콘드리아 항상성 저해 및 미토파지 장애와 관련 있음을 확인했다. 또한 APP-CTFs의 축적은 γ-secretase 차단에 의한 것이며 PSEN 결핍 세포에서 발생하기 때문에 정상 유도 신경줄기세포에서 유전자 편집 기술을 통해 PSEN 넉아웃 세포를 제작했다. 결과적으로 PSEN1과 PSEN2가 넉아웃된 유도 신경줄기세포는 미토콘드리아 기능 저하와 미토파지 억제를 초래했으며 이차원 신경세포와 삼차원 오가노이드에서 신경세포의 분화 저하를 보였다. 본 연구의 두 번째 장에서는 니만-피크 C1형 환자 유래 삼차원 뇌 오가노이드를 확립하여 질환 특이적 형질을 재현하고 약물 스크리닝에 적합한 질환 모델임을 확인했다. 니만-피크 C1형 오가노이드는 정상 오가노이드에 비해 크기, 세포 증식, 신경 분화에서 감소하지만 세포 사멸은 증가되어 있었다. 또한 니만-피크 C1형 오가노이드 내부의 리소좀에 축적된 콜레스테롤은 자가포식과정의 기능 저하와 관련이 높음을 확인했다. 제작된 니만-피크 C1형 오가노이드가 약물 테스트에 적합한 모델임을 증명하기 위해 콜레스테롤 감소에 효과적인 것으로 알려진 하이드록시프로필 베타 사이클로덱신 (HPβCD)과 더불어 히스톤 탈아세틸화 억제제 중 하나인 발프로 산 (valproic acid) 처리로 질환의 회복을 확인했다. 따라서 본 연구에서는 니만-피크 C1형 질환 환자 유래 삼차원 뇌 오가노이드를 확립하여 질환의 치료 기술을 개발하는데 유용성을 제시한다. 뇌 오가노이드는 질환 모델링뿐만이 아니라 바이러스 감염을 통해 병원성 기전 및 감염경로에 대한 연구에 적용할 수 있다. 이를 위해 본 연구의 세 번째 장에서는 뇌 오가노이드에 지카 바이러스를 감염시켜 알츠하이머 질환 표현형이 증가함을 확인했다. 이는 지카 바이러스가 감염된 뇌 오가노이드에서 지속적인 ER stress가 관찰되었고, 결과적으로 BACE와 GSK3β를 촉진해 아밀로이드 베타와 과인산화된 타우 단백질이 증가함을 확인했다. 바이러스 감염은 알츠하이머의 위험 요인 중 하나이며, 지카 바이러스 감염이 알츠하이머 병리학적 특징을 촉발할 수 있음을 뇌 오가노이드 모델을 통해 입증했다. 본 연구에서는 알츠하이머 및 니만-피크 C1형의 연구 플랫폼으로서 환자 유래 유도 신경줄기세포 및 뇌 오가노이드를 제시했다. 이 모델을 통해 알츠하이머의 초기병리와 관련한 미토콘드리아 기능 저하를 확인하고 바이러스 감염에 의해 알츠하이머 병리적 특징이 증가하는 현상을 구현하였다. 또한 니만-피크 C1형 뇌 오가노이드 제작을 통해 리소좀 축적 질환 관련 특징과 약물 효능을 확인했다. 이로써 알츠하이머 및 니만-피크 C1형의 이차원 유도 신경줄기세포부터 삼차원 뇌 오가노이드까지 모델 확립을 통해 메커니즘 스터디 및 신약 스크리닝 플랫폼을 제시한다.

Alzheimers disease (AD) and Niemann-Pick type C disease (NPC) are progressive neurodegenerative diseases, and although many studies have been conducted, the mechanism or effective treatment for the cause of the diseases have not been elucidated. Despite multiple attempts on developing treatments by several pharmaceutical companies, current treatments do not target the disease directly but only show the effects of relieving symptoms. One of the reasons for this failure is the lack of experimental models that mimics human physiology and the biological changes that occur during the onset and progression of diseases in a human brain. Therefore, it is necessary to develop a new model capable of mimicking actual human brain physiology. Recently, two-dimensional (2D) induced neural stem cell models derived from patient somatic cells are used as a screening platform for disease research and drug development. In addition, as mini-brain organoids with a three-dimensional (3D) structure that can structurally and functionally mimic the human brain by utilizing the self-organizing ability of stem cells have been developed, disease modeling and drug screening are actively progressing. Therefore, these studies intend to present a therapeutic platform for AD and NPC disease ranging from 2D cell models to 3D organoids to verify pathological characteristics, causes, and drug effects of cells of pathological phenomena. In the first chapter of this study, familial AD patients fibroblast-derived induced neural stem cells (iNSCs) were used to study mitochondrial dysfunction phenotypes contributing to the early pathology of AD. I represented that the accumulation of C-terminal fragments (APP-CTFs) generated in the amyloidogenic pathway of amyloid precursor protein (APP) was associated with mitochondrial homeostasis inhibition and mitophagy dysfunction. In addition, since the accumulation of APP-CTF is due to the γ-secretase blockade and occurs in PSEN-deficient cells, PSEN knockout cells were generated from normal induced neural stem cells through gene editing technology. As a result, PSEN1 and PSEN2 knockout-induced neural stem cells showed not only decreased mitochondrial function and mitophagy inhibition, but also decreased neuronal differentiation in 2D neuron and 3D organoids. In the second chapter of this study, 3D brain organoids derived from the patient's iNSCs were established to represent disease-specific traits and apply for drug screening. I confirmed that size, cell proliferation, and neuronal differentiation were downregulated in NPC organoids compared to wild-type organoids, while the cell death increased. I also represented that the lysosomal cholesterol accumulation in NPC organoids was highly related to the impairment of autophagy. These pathological phenotypes observed in NPC organoids were rescued by treatment with 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPBCD) and Valproic acid (VPA), which are known to be effective candidates for NPC disease. Therefore, in this study, NPC brain organoids were established for the first time to verify various phenotypes and drug efficacy of the disease treatments. Organoids are applicable not only to disease modeling, but also to the study of pathogenic mechanisms and transmission routes of virus infection. In the third chapter of this study, I represented that zika virus infection increase AD phenotype. I confirmed that continuous ER stress was observed in brain organoids with zika virus, and as a result, the level of amyloid beta (Aβ) and phosphorylated tau protein was increased by BACE and GSK3β. Virus infection can be one of the risk factors for AD, and it has been proven that zika virus infection can trigger AD pathological features in brain organoids. Through the results of these studies, I generated AD and NPC patient-derived induced neural stem cells and brain organoids as the disease research platform. In these models, I confirmed the mitochondrial dysfunction related to the early pathology of the disease and the increased AD pathological characteristics by zika virus infection. In addition, lysosomal storage disease-related characteristics and drug efficacy were confirmed in NPC brain organoids. Taken together, I present the mechanism study and drug screening platform by establishing models from 2D induced neural stem cells to 3D brain organoids of AD and NPC diseases.