Effect of biofilm formation by antimicrobial-resistant gram-negative bacteria in cold storage on survival in dairy processing lines

Abstract

Antimicrobial-resistant gram-negative bacteria are a matter of concern in the dairy industry. They can be transmitted to humans via the consumption of dairy products, and their persistence in dairy processing lines and the final products can adversely impact on product quality. Thus, it is important to study the distribution of antimicrobial-resistant gram-negative bacteria and their survival characteristics in dairy processes. Here, the distribution of antimicrobial-resistant gram-negative bacteria in dairy processing lines was investigated and their ability to form biofilms under conditions similar to those in dairy processing environments was evaluated. Furthermore, the relative expression of general and heat stress-associated genes (dnaK, dnaJ, groEL, and rpoS) as well as spoilage-related gene (aprX) was compared between biofilms and planktonic cells under conditions of consecutive stress similar to those in dairy processing lines. A total of 34 gram-negative bacteria were isolated from five different dairy processing plants, and most (82.4%) of them were resistant to one or more antimicrobial agents. In addition, biofilm formation ability of the bacterial strains at 5℃ increased with the exposure time, and the proportion of the strong biofilm-forming strains according to their isolation source was the highest in pasteurized milk (100%) and the lowest in raw milk (26.3%). With regard to heat tolerance, cells in biofilms remained viable under heat treatment, whereas all planktonic cells of the selected strains died. Likewise, expression of the heat shock protein-related genes (dnaK, dnaJ, and groEL) significantly increased with heat treatment in the biofilms but mostly decreased in the planktonic cells. Our findings suggest that biofilm formation in raw milk under storage conditions may improve the tolerance of antimicrobial-resistant gram-negative bacteria to pasteurization, thereby increasing their persistence in dairy processing lines and dairy products. Furthermore, the difference in response to heat stress between biofilm and planktonic cells may be attributed to the differential expression of genes encoding heat shock proteins. This study contributes to the understanding of how gram-negative bacteria survive and persist under conditions of consecutive stresses in dairy processing procedures and the potential mechanism underlying heat tolerance in biofilms.

최근 낙농 산업에서 항생제 내성 그람음성균 발생은 문제점으로 대두되고 있다. 항생제 내성 그람음성균이 오염된 유제품 섭취 시 인간에게 항생제 내성을 전파시킬 가능성이 있으며, 완제품이 만들어질 때까지 살아남을 경우 품질 저하를 시킨다고 알려져 있다. 따라서 유가공장에서의 항생제 내성 그람음성균 분포 현황과 유가공장 환경에서의 생존특성에 대한 연구가 필요하다. 이 연구는 유가공장 여러 공정에서의 항생제 내성 그람음성균의 분포와 유가공장 환경과 유사한 조건에서의 바이오필름 형성능을 조사하고자 하였다. 더 나아가서 유가공장에서 흔히 발생하는 연속적인 스트레스 조건에 노출시켰을 때 바이오필름과 플랑크토닉 균주간에 열 저항성 관련 유전자 (dnaK, dnaJ, groEL, rpoS)와 부패 관련 유전자 (aprX)의 상대적인 발현량을 비교하고자 하였다. 5곳의 유가공장에서 그람음성균 총 34주가 분리되었으며 대부분 (82.4%) 한 개 이상의 항생제에 대해 내성을 보였다. 또한, 5℃에서의 바이오필름 형성능은 대체로 노출 시간에 따라 증가하는 것이 확인되었으며 분리원에 따른 강한 바이오필름 형성 균주는 살균 후 원유 (100%)에서 가장 많이 확인되었고, 살균 전 원유 (26.3%)에서는 가장 적은 것으로 확인되었다. 바이오필름 형성 균주의 경우 고온의 열 처리에도 모두 생존하였으나, 플랑크토닉 균주는 모두 사멸하였다. 열 충격 단백질 (Heat-shock protein) 합성에 관여하는 유전자(dnaK, dnaJ, groEL)의 발현 역시 열 처리시 바이오필름 형성 균주에서 유의하게 증가하였으나, 플랑크토닉 균주에서는 대체로 감소하였다. 본 연구 결과는 살균 전 원유의 저온 저장 조건에서 항생제 내성 그람음성균이 바이오필름을 형성하게 되면 고온 살균에 대한 내성이 향상되어 유가공장에서의 지속성이 증가할 수 있음을 시사한다. 또한 바이오필름과 플랑크토닉 균주 사이의 열 스트레스에 대한 반응 차이는 열 충격 단백질 관련 유전자의 발현량 차이에 기인할 수 있다. 본 연구는 그람음성균이 유가공장에서 발생하는 연속적인 스트레스 조건에서의 생존 전략과 바이오필름의 열 저항성에 기초가 되는 메커니즘을 이해하는 데에 기여할 것으로 생각되어진다.