Sensitivity enhancement of colorimetric polydiacetylene-based biosensors towards highly sensitive real-time diagnostic method for clinical applications

Abstract

Combining the data-oriented decision making and the desire for higher quality of life, there is an increasing interest in diagnosing and monitoring the state of ones health. In particular, a widespread pandemic in recent years has increased the necessity for fast and reliable screening methods. To meet the demand, various types of biosensors have been proposed and researched. Polydiacetylene (PDA) is a type of conjugated polymer widely researched as biosensor materials for its low cost and expandable chemistry. Also, the unique optical properties (colorimetric change and fluorescence development) and lipid-bilayer cell membrane-like structure of self-assembled PDA liposomes allow interaction with diverse biomolecules, which are advantageous for biosensor applications. However, most of the developed PDA-based biosensors are yet far from commercial adoption because they have been developed based on pre-treated or purified target biomolecule, thereby questioning the fidelity in real applications. In addition, the sensitivity of PDA-based biosensors varies widely, limiting their applicability for the detection of trace amounts of analytes. Therefore, to improve a PDA-based sensors commercial applicability, achieving higher selectivity as well as sensitivity is a must. In this dissertation, a study on simple, sensitive, and rapid self-signaling PDA-based sensors that detect activated platelet, a specific target molecule, in a whole blood specimen without any pre-treatment is presented. Also, a universally applicable strategy to enhance the sensitivity of PDA sensors by pre-occupying the PDA liposome surface with artificial analytes (dummies) is reported, which can generate more effective stress to trigger the optical signals of the PDA backbone when biological target molecules are captured at the PDA liposome surface. The necessity of a simple yet accurate platelet activation measurement has been increasing in clinical medicine to regulate a proper dose of antiplatelet drugs for patients having clinical outcomes in acute situations such as angina pectoris, stroke, or peripheral vascular disease or procedures involving angioplasty or coronary thrombolysis. A self-signaling PDA liposome microarray has been developed to detect activated platelets from whole blood samples in a single step. A specific antibody, 9F9 antibody, binding to platelet-bound fibrinogen was selected and conjugated to the PDA liposome microarray to quantify the fibrinogen-bound platelets. The developed PDA liposome−9F9 microarray generated an intense fluorescence signal when activated platelets in whole blood were introduced and also successfully distinguished the reduced platelet activation in the presence of Tirofiban, a model antiplatelet drug. The results of this single-step benchtop assay incorporate simple, sensitive, and rapid attributes that can detect the extent of platelet activation prior to needed clinical procedures. To improve the sensitivity, a new PDA sensor platform having pre-occupied artificial target molecules named as dummies is also developed. The dummy molecules generate repulsion force on the PDA sensor surface with analytes more effectively; thus, both device sensitivity and optical signal intensity are enhanced. It was discovered that the enhancement of sensory properties is maximized when the volumetric sizes of the analyte and dummy are close to each other. This dummy approach is also verified to be comparable with various PDA-based sensors. The dummy strategy was applied to the previously studied Neomycin and Surfactin detecting PDA sensors, and increased sensitivity of both sensors was observed. When the dummy strategy was combined with another sensitivity enhancement method based on phospholipid incorporation to make the PDA liposome more flexible, the combined effect enhanced the sensitivity by 16 times.

Polydiacetylene(PDA) 공액 고분자는 독특한 광학적 특성으로 인해 다양한 센서 제작에 사용된다. 특히, 공액 고분자와 결합 가능한 다양한 생체 분자들 간의 상호작용으로 인한 색변화 및 형광 발현 효과는 이 PDA 기반 센서를 통해 다양한 생체 분자를 검출할 수 있도록 하였다. 하지만 현재까지 개발된 PDA 기반 센서에는 몇 가지 결점이 존재한다. 땀, 체액, 혈액 등 전처리 및 분리 과정을 거치지 않은 생체 샘플을 PDA 기반 센서에 사용하였을 경우, 다양한 불특정 생체 분자들에 의해 광학적 특성이 간섭 받을 수 있다. 또한, 센서를 통해 표적물질을 검출하기 위해서는 많은 양의 표적물질이 PDA 센서 표면에 결합되어야 하지만 낮은 농도의 표적물질을 포함하는 샘플의 경우 검출이 어렵다는 단점이 존재한다. 본 논문에서는 전처리 과정없이 생체 샘플에서 간단하며 빠르고 정확하게 표적물질을 검출할 수 있는 PDA기반 센서를 제작하는 방식에 대해 설명할 것이다. 또한, 인위적으로 만들어진 표적물질을 이용하여 PDA 기반 센서의 민감도를 증가시켜 보다 정확하게 표적물질을 검출할 수 있는 센서 제작 방식에 대해서 설명할 것이다. 혈소판의 활성도를 간단하게 측정하는 방식을 개발하는 것은 임상의학에서 중요한 화제이다. 특히 여러가지 혈액 및 혈관 질병에 의해 항혈소판제를 투약하는 환자의 경우, 혈소판 활성도 판단은 환자의 신체 상태를 확인하는데 아주 중요한 요소이다. 전처리 과정없이 혈액 샘플을 사용하여 혈소판 활성도를 측정하기 위해 피브리노겐과 결합한 혈소판만을 특정하여 결합할 수 있는 9F9 항체를 PDA 기반 마이크로어레이 센서에 접목시켜 혈소판의 활성도를 측정하는 연구를 실행했다. 특히, 항혈소판제 중 하나인 Tirofiban을 이용, 혈소판 활성도에 따른 PDA 센서의 형광신호를 측정하여 정량적인 혈소판 활성도를 확인할 수 있다. Polydiacetylene 공액 고분자는 그 광학적 특성에 의하여 다양한 센서 제작에 사용된다. 하지만 이 공액 고분자 기반 센서 표면에 표적물질이 일정 수 이상 결합하지 못할 경우, 결합한 표적물질 간의 반발력에 의한 광학특성 변화가 신호로 사용되는 이 PDA기반 센서로는 표적물질을 확인할 수 없다는 단점이 존재한다. 따라서 본 연구는 인공 표적물질(더미)을 PDA 기반 센서 표면에 결합하는 방식을 통해 표적물질과 추가적인 반발력을 생성하여 센서의 민감도를 증가시키는 방식을 고안하였다. 특히, 더미 물질이 PDA 센서 표면에서 표적물질과 3차원적 공간 점유도가 비슷할 경우, 센서의 민감도 증가가 가장 크다는 것을 밝혀냈다. 또한 기존에 연구되었던 PDA 기반 Neomycin과 Surfactin 센서에 동일한 더미 물질을 적용한 결과, 센서의 민감도 뿐만 아니라 형광신호가 증폭되는 결과를 확인했다. 더욱이 기존 PDA 기반 센서의 민감도를 증가시키기 위해 연구되었던 PDA-인지질 초거대 분자 활용법에 이 더미 시스템을 접목시킨 센서로 Neomycin을 검출해 본 결과 약 16배의 민감도 증가를 확인하였다.