Characterization of intestinal macrophage populations in the mouse colon lamina propria using single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics

Abstract

Despite the advancements in the next-generation sequencing, a full characterization of transcriptomes of the diverse intestinal macrophage populations within the mouse colon lamina propria has yet to be done. As these cells are implicated in various conditions, including gut inflammation and colorectal cancer, there is a need to establish a comparator for the transcriptomes of these populations in homeostatic conditions to be used as a reference to compare with data from the various conditions. To this end, I utilized single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics to investigate the transcriptomes and the location of macrophage populations within the mouse colon lamina propria. Due to the lack of reference transcriptome datasets for intestinal macrophage populations, I manually annotated each cluster in the single-cell RNA sequencing results by looking at its top expressed genes and the expression patterns of known markers for various cell types to find four distinct populations of macrophages. The Itgaxhi (CD11c)-macrophages, located in close proximity to the epithelium, expressed high levels of genes associated with antigen presentation, such as Cd74 and H2-Eb1, and were upregulated for processes related to adaptive immunity, suggesting their involvement in antigen presentation and induction of Th17 cells, which have previously been shown to promote intestinal health. Another population of Mrc1hi (CD206)-macrophages were found closer to the base of the lamina propria and were enriched for both anti-inflammatory and defense-related genes, including Cd163 and Selenop, suggesting that they are involved in maintaining immune tolerance while also contributing to intestinal immunity. They retained high levels of MHCII-related genes and were enriched for processes relating to endocytosis, suggesting that they still reserve high antigen presenting potential. The two other populations were found to be immature macrophages that are precursors of the CD11c- and CD206-macrophages, and their identity was verified through trajectory analysis and reference-based annotation. As the genetic characteristics of immature macrophages have not yet been investigated, I, for the first time, described the characteristics of these populations of immature macrophages to express high levels of Nfkbia, Tnfaip3, and Socs3, which transcribe for the anti-inflammatory inhibitors IκBα, A20, and SOCS3, respectively. The immature macrophage populations also expressed high levels of genes for the inflammatory cytokines such as TNF and IL-1β as well, suggesting that the expression of genes for the aforementioned anti-inflammatory inhibitors may serve a purpose in achieving the immune tolerance observed in mature intestinal macrophages. The results presented in this study may prove valuable as reference transcriptomes for further studies investigating the changes to the transcriptomes and locations of intestinal macrophage populations during various intestinal conditions.

차세대 서열 분석 (next-generation sequencing)의 발전에도 불구하고, 마우스 대장의 점막고유층에 존재하는 큰포식세포의 전장 전사체 분석은 아직 이루어지지 않았다. 큰포식세포 (intestinal macrophage)는 장에서의 염증, 암 등의 다양한 상태에 관여하기 때문에, 이러한 조건에서 추출한 데이터와 비교할 때 비교 대상으로 사용할 항상성 조건에서의 큰포식세포의 특성을 확립할 필요가 있다. 이를 위하여 단일 세포 RNA 염기서열과 공간전사체 분석을 활용하여 마우스 대장 점막고유층 내 큰포식세포의 전사체와 위치를 조사하였다. 장내 큰포식세포에 대한 참조 전사체 데이터세트가 부족하기에, 단일 세포 RNA 염기서열 결과에서 특이 발현 유전자와 다양한 세포 유형에 대해 이미 알려진 마커의 발현 패턴을 살펴 수동으로 주석을 달았으며, 네 개의 큰포식세포 집단을 찾았다. 상피에 근접하게 위치한 Itgax (CD11c) 발현이 높은 큰포식세포 집단 (CD11c-큰포식세포 집단)은 Cd74와 H2-Eb1을 비롯한 항원 제시와 관련된 유전자를 높게 발현했으며, 적응면역과 관련된 과정 (processes)와 크게 관련되어 있었다. 따라서 이 집단은 항원 제시와, 장 건강에 기여하는 것으로 알려진 Th17 적응면역 세포의 분화를 유도하는 역할을 한다고 유추할 수 있었다. 또 하나의 Mrc1 (CD206)를 높이 발현하는 큰포식세포 집단(CD206-큰포식세포 집단)은 점막고유층의 기저부에서 더 가깝게 위치하였고, Cd163과 Selenop 등의 항염증 및 방어에 관련된 유전자를 높게 발현하였다. 따라서 이 집단은 면역 내성을 유지하는 동시에 장내 면역에도 기여한다는 것을 유추할 수 있었다. 다른 두 큰포식세포 집단은 둘 다 미성숙 큰포식세포 집단으로, 각각 CD11c-와 CD206-큰포식세포 집단의 전구체임을 궤적분석 (trajectory analysis)와 참조 기반 주석 (reference-based annotation)을 통해 확인하였다. 아직 미성숙 큰포식세포의 유전적 특성은 연구되어 있지 않기에, 처음으로 두 미성숙 큰포식세포 집단이 공통으로 억제 단백질 IκBα, A20와 SOCS3에 대한 유전자인 Nfkbia, Tnfaip3와 Socs3를 높게 발현하는 것을 밝혔다. 또한, 두 미성숙 큰포식세포 집단에서는 다른 두 큰포식세포 집단에서는 발현이 낮았던 TNF와 IL-1β를 비롯한 염증성 사이토카인에 대한 유전자의 발현도 높았기에, 이를 통하여 앞서 언급한 Nfkbia, Tnfaip3와 Socs3의 발현이 장내 성숙한 큰포식세포에서 관찰되는 면역 내성을 달성하는데 기여한다고 추측할 수 있다. 본 연구를 통해 도출된 결과는 장에서의 다양한 상태에서의 데이터와 비교하기 위한 참조 전사체로서 가치가 있을 것으로 판단한다.