The roles of pore-lining residues in the physiological properties of TRPC4: response to G protein and voltage-dependency

Abstract

TRPC 채널은 여러 조직에 발현되는 비선택성 양이온통로이며 칼슘 투과성도 있어서 생리적 기능이 주목받고 있다. 7개의 TRPC subtypes 중, TRPC1 과 TRPC4는 이형접합체(heteromer)를 형성하면서 이온통로 기능을 가질 뿐만 아니라, TRPC4의 동형접합체(homomer)와 다른 형태의 전압의존성을 보인다. TRPC4 의 Cryo-EM 구조에서 통로 바깥에 가까운 내벽에 있는 G577과 N580이 이온 투과도에 결정적일 것이 유추되었다. 또한, 통로 아래쪽 내벽에 있는 Ile716 과 Asn621 은 개폐를 조절할 것으로 유추되었다. 하지만 이에 대한 실제 기능적 실험은 아직 이루어지지 않았다. 이들 아미노산 잔기의 돌연변이 유도를 통해서 TRPC4의 특성을 결정하는데 중요한 구조적 단서를 얻을 수 있기에 본 연구를 수행하였다. TRPC4 의 4개 pore-lining residues (G, N, I, N) TRPC1의 residue 대응물 (S, H, V, H) 로 돌연변이 시켰다. 이들에 대한 단일-및 복합적 돌연변이들에 대한 전기생리학적 분석을 통해, 특히 단위면적 당 전류밀도 및 전류-전압 (I-V) 관계를 분석하였다. TRPC4의 활성화를 Englerin-A 뿐만 아니라 GTPS 와 Gi2QL 를 통한 자극과 비교하였다. G577S와 N580H 변이체에서는 EA에 대한 반응이 나오면서도 지단백에 대한 반응이 사라지는 현상을 관찰하였다. 전도도막전압 의존성은 G577S와 N580H 변이체에서 정상과는 다르게 특이한 모양이 관찰되었다. 이들 돌연변이에서 얻은 결과들은 단순한 방향으로 나타나지는 않았지만, TRPC4의 분자구조와 기능의 상관관계에 대한 통찰을 제공하는 근거가 되었다.

TRPC channels are calcium permeable, non-selective cation channels that are widely distributed in tissues. Among 7 TRPC subtypes, TRPC1 and TRPC4 are found to have an ion channel function while forming heteromeric channels, and also show a voltage dependency that is comparatively different from that of a TRPC4/4 homomeric channel. A Cryo-EM structure of TRPC4 has shown that G577 and N580 are key residues of the extracellular selectivity filter. In addition, Ile617 and Asn621 at the bottom of S6 defining a lower gate are inferred to regulate opening of the channel. However, actual functional tests have not been conducted yet. With such recent findings of the structure of TRPC4, we hypothesize that mutations within this pore region may possibly lead to findings of a critical region. Four pore-lining residues of TRPC4 (G, N, I, and N) were mutated into structural counterparts of TRPC1 (S, H, V, and H) by site-directed mutagenesis, and were confirmed by sequencing. We measured whole-cell currents of those mutants to verify any effect of such mutation in current-voltage (I-V) relationship or conductance of the channels. The activation of the TRPC4 channel was investigated by stimulating with Englerin A, GTPyS and Gi2QL. In G577S mutant, the response to EA was observed while the response to G protein stimulators was not. In addition, the voltage dependency of the mutants G577S and N580H was also observed to be different from what is expected in TRPC4 channel. The results observed from these mutations were not simple, but they were observed to provide a basis of further insights into the correlation between the molecular structure and function of TRPC4.