Identification of non-Helicobacter pylori gastric bacteria which stimulate interleukin-8 production in gastric epithelial cells and revealing the pathogenic mechanism

Abstract

Introduction: The role of non-H. pylori gastric bacteria (NHGB) in gastric inflammation is largely unknown. The aim of this study was to investigate their ability of inducing interleukin-8 (IL-8) production from gastric epithelial cells and to demonstrate the underlying mechanism. Methods: Gastric juice was obtained from 13 patients with gastric cancer. After culture, isolated NHGB were identified by 16S rRNA gene sequencing. Human gastric epithelial cells (AGS) were co-cultured with the bacteria, and IL-8 concentrations in cell culture supernatants were quantified by enzyme-linked immunosorbent assay. We additionally performed inhibition studies using inhibitors to TLR4, NOD1, ERK, p38, JNK, and NF-κB, to reveal the mechanism of pathogen recognition, intracellular signal transduction and translational regulation of IL-8 by the bacteria. Results: Sixteen species of NHGB were isolated from gastric juice. After inoculation to AGS cells, Neisseria perflava potently stimulated IL-8 secretion in a time- and dose- dependent manner, which was attenuated when concurrently treated with NOD1 inhibitor. When AGS cells were co-treated with N. perflava and inhibitors of ERK, p38 or JNK, respectively, to determine the role of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) in IL-8 production, a significant reduction in IL-8 production was observed after treatment with p38 inhibitor. The cells pretreated with NF-κB inhibitor produced significantly reduced level of IL-8 when stimulated with N. perflava. Conclusions: This is the first study demonstrating that N. perflava induces MAPK phosphorylation and NF-κB activation via a NOD1-dependent mechanism in gastric epithelial cells. N. perflava may contribute to the inflammation in gastric mucosa.

서론: 위 내의 염증 반응에서 헬리코박터 파일로리 이외의 세균이 가지는 역할에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 이러한 세균들이 위 상피 세포에서 IL-8의 생성을 유도하는 능력과 그 기전을 살펴보고자 하였다. 방법: 13명의 위암 환자에게서 채집한 위액을 이용해 헬리코박터 파일로리 이외의 세균을 배양, 분리한 뒤, 이를 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 동정하였다. 인간 상피세포주 (AGS)를 세균과 함께 배양한 뒤, 배양상청액의 IL-8 농도를 효소면역측정법으로 측정하였다. 또한, 병원체의 인식 및 세포내 신호 전달 기전, 세균에 의한 IL-8 전사 조절 기전을 밝히기 위해 TLR4, NOD1, ERK, p38, JNK 및 NF-kB에 대한 억제제를 이용한 저해 시험을 진행하였다. 결과: 위액에서 총 16 종의 비-헬리코박터 파일로리 균주가 배양되었다. 이를 각각 AGS 세포에 접종하여 배양하였을 때, Neisseria perflava는 시간 및 용량 의존적으로 IL-8의 분비를 뚜렷하게 촉진하였고, NOD1 억제제를 함께 처리하였을 때에는 해당 반응이 약화되었다. IL-8 생성에 있어 MAPKs의 역할을 확인하기 위해 AGS 세포에 N. perflava와 함께 ERK, p38, JNK 억제제를 각각 처리한 결과, p38 억제제 처리시 IL-8의 생성이 유의하게 감소된 것을 확인하였다. AGS 세포에 NF-kB 억제제를 처리 후 N. perflava 배양시, IL-8의 생성이 유의하게 감소하였다. 결론: 본 연구는 N. perflava가 위 상피 세포에서 NOD1 의존적으로 MAPK 인산화와 NF-kB 활성화를 유도함을 처음으로 보여주었다. 이를 통해 N. perflava는 위 점막의 염증 반응에 기여할 가능성이 있음을 알 수 있다.