블레오마이신 유도 폐섬유증 모델에서 중간엽 줄기세포치료의 효과

Abstract

Background: Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a rare and progressive fibrotic lung disease without a cure. Although mesenchymal stem cells (MSCs) have been reported to ameliorate lung inflammation and fibrosis in animal models of pulmonary fibrosis, studies on their mechanism of action are lacking. Therefore, we aimed to determine the change of various immune cells, especially macrophages and monocytes, involved in the effect of MSC treatment on pulmonary fibrosis.

Methods: We collected and analyzed explanted lung tissue and blood from IPF patients who underwent lung transplantation. We established a pulmonary fibrosis model by intratracheal administration of bleomycin (BLM) to 8-week-old mice. We administered human umbilical cord-derived MSCs intravenously or intratracheally on the 10th day, then analyzed the lungs on the 14th day. Flow cytometry was performed to analyze immune cell characteristics, and gene expression levels were examined through quantitative reverse transcription-polymerase chain reactions.

Results: In the histologic analysis of human explanted lung tissue, the fibrotic areas contained a larger number of macrophages and monocytes compared to the preserved area of the lungs. When human monocyte-derived macrophages (MoMs) were stimulated with interleukin (IL)-13 in vitro, expression of type 2 macrophage (M2) markers was more prominent in MoMs from the classical monocytes than those from the intermediate or non-classical monocytes. And MSCs suppressed M2 markers independent of MoM subsets. In the bleomyin-induced pulmonary fibrosis mouse model, the increased inflammatory cells in the bronchoalveolar lavage fluid and increased lung fibrosis were significantly reduced by MSC treatment. The effects of MSC tended to be more significant with intravenous administration than intratracheal administration. Both M1 and M2 MoMs were upregulated in the BLM-treated mice. M2c, a subset of M2 MoM, was significantly reduced by MSC treatment. Among MoMs derived from Ly6C+ monocytes, M2 Ly6C+ MoMs were significantly decreased by the intravenous administration of MSCs rather than intratracheal administration.

Conclusions: Inflammatory classical monocytes may play a role in the lung fibrosis of human IPF and BLM-induced pulmonary fibrosis. Intravenous rather than intratracheal administration of MSCs may ameliorate pulmonary fibrosis by inhibiting the differentiation of monocytes into M2 MoMs.

서론: 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)은 아직까지 호전시키는 치료제가 개발되지 않은 난치성 질환이다. 폐섬유증 동물모델에서 폐의 염증과 섬유화를 개선시키는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)의 효과가 보고되었으나 아직까지 그 작용 기전에 대한 연구는 많이 부족하다. 본 연구에서는 폐섬유증의 면역학적 변화를 단핵구 및 대식세포를 중심으로 살펴보고, MSC 치료가 이러한 면역세포들에 어떠한 효과를 보이는지 확인하고자 하였다.

방법: 폐이식을 시행 받은 IPF 환자의 적출 폐 조직과 혈액을 수집하여 단핵구와 대식세포를 분석하였다. 생체실험(in vivo experiment)을 위해 블레오마이신(bleomycin, BLM)을 8주령 C57BL/6 마우스의 기관 내로 투여하여 폐섬유증 모델을 확립한 후 인간 제대혈 유래 MSC를 10일 째 정맥 또는 기관 내로 투여하고 14일째 비교 분석하였다. 면역세포에 대한 분석을 위해 유세포분석을 시행하였고 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 유전자 발현 정도를 분석하였다.

결과: IPF 환자의 폐 조직에서 대식세포 및 단핵구, 특히 고전적 단핵구가 유의하게 증가함을 확인하였다. IPF 환자의 단핵구에서 분화시킨 대식세포(monocyte-derived macrophage, MoM)들을 IL-13으로 자극하였을 때, 고전적 단핵구 유래 대식세포에서 2형 대식세포(type 2 macrophage, M2)의 유의한 활성화가 관찰되었고, 이 배양 상청액은 인간 폐 섬유아세포의 섬유화 특성을 유도하였으나 이 효과는 MSC에 의해 유의하게 억제되었다. BLM 그룹에서 증가하였던 염증세포 및 섬유화 지표들 역시 MSC 투여 시 감소하였으며, 기도 내 투여보다 정맥 내 투여 시 좀더 유의한 결과를 보였다. 폐대식세포에 대한 추가 분석 결과, BLM 투여 시 SiglecF-CD11b+CD11c-대식세포 즉 MoM에서 M1, M2 모두 그 비율이 증가하였는데, MSC 투여는 그 중 M2를 유의하게 감소시켰다. M2 아형에 대한 분석 결과 MSC 정맥 투여 시 M2c만 유의하게 감소하였다. 또한 BLM 그룹에서 증가하였던 Ly6c+ MoM은 정맥 투여된 MSC에 의해 유의하게 감소하였으며, 특히 M2 Ly6c+ MoM이 유의하게 감소하였다.

결론: MSC 투여가 BLM 유도 폐섬유화를 감소시키는 기전에는 여러 면역세포들이 관여하며 특히 염증성 대식세포를 선택적으로 감소시켰는데, 특히 M2, 그 중 M2c를 유의하게 감소시켰다. 이러한 MSC의 효과는 고전적 MoM에서 유의하게 관찰되었고, 기관 내 투여보다 정맥 투여 시 더 효과적이었다.