Ginger and its two active components induce autophagy and apoptosis through C/EBP Homologous protein in oral squamous cell carcinoma

Abstract

Background: Rhizomes of Zingiber officinale (Z. officinale) display anti-oxidant, anti-inflammatory, anti-ulcer, and anti-tumor properties. I examined the effects of an ethanol extract of Z. officinale rhizomes (ZOE) against human oral squamous cell carcinoma (OSCC) in vitro and identified the components responsible for its pharmacological activity. Methods: I performed a Cell Counting Kit-8, soft agar, and trypan blue exclusion assays to examine the growth inhibitory effect of ZOE in human OSCC cell lines. ZOE-induced apoptosis in human OSCC cell lines was determined by DAPI staining, measurement of the sub-G1 population, annexin V/PI double staining, and western blot analysis. I measured the effect of ZOE on autophagy and autophagic flux by microscopic analysis. High-performance liquid chromatography (HPLC) analysis was used to identify the active components of ZOE. Results: ZOE exhibited an anti-proliferative effect on human OSCC cells and induced apoptosis as evidenced by increased cleaved PARP levels and apoptotic cells by fluorescence staining and flow cytometric analysis. ZOE treatment also induced LC3-II conversion, increased formation of autophagosomes or autolysosomes, and accumulation of endogenous LC3 puncta. However, ZOE disrupted autophagic flux by blocking lysosomal acidification, which was similar to that of chloroquine, a late autophagy inhibitor. Furthermore, ZOE simultaneously induced autophagy initiation and apoptosis induction through the accumulation of C/EBP homologous protein (CHOP), an endoplasmic reticulum (ER) stress marker protein. An HPLC analysis of ZOE revealed that 1-dehydro-6-gingerdione and 8-shogaol were the active components, which were sufficient to induce autophagy initiation and apoptosis induction by enhancing CHOP expression. Conclusion: The results suggest that ZOE and its two active components target CHOP, initiate autophagy and apoptosis, and may be useful therapeutics against human OSCC.

1. 목적: 생강추출물 및 주요 생리활성물질은 여러 암종에서 다양한 매커니즘을 통해 항암 효능을 보이는 것으로 알려져 있다. 하지만 구강 편평상피세포암종에서 이들의 항암 효능에 대한 연구는 현재까지 미미한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 구강 편평상피세포암종 세포주에서 자가포식 (autophagy) 및 세포사멸 (apoptosis)을 유도하는 생강추출물과 주요 생리활성물질인 1-dehydro-6-gingerdione 및 8-shogaol의 항암 효능에 대해 조사하였다. 2. 재료 및 방법: 구강 편평상피세포암종에서 생강추출물 및 생리활성물질의 세포사멸에 대한 효능은 cleaved PARP 단백질의 검출, DAPI 염색, sub-G1 분석 또는 Annexin V/PI double staining을 통해 평가되었다. 생강추출물 및 생리활성물질의 자가포식에 대한 효능은 LC3-Ⅱ 단백질의 검출, 투과전자현미경 관찰, acidic vesicular organelle 또는 LC3 puncta 형성을 관찰함으로써 평가되었다. 또한, 생강추출물의 자가포식 유동 (autophagic flux)에 대한 효능은 자가포식 억제제인 클로로퀸 (Chloroquine)을 병용투여 한 후, LC3-Ⅱ 단백질 검출, LC3 puncta 형성 및 mCherry-GFP-LC3 형광벡터를 사용함으로써 증명되었다. 소포체 스트레스 (ER stress)는 C/EBP Homologous protein (CHOP)의 검출을 통해 확인되었다. 생강추출물의 생리활성물질은 gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS)를 통해 확인 및 분리되었다. 3. 결과 및 고찰: 생강추출물과 주요 생리활성물질인 1-dehydro-6-gingerdione 및 8-shogaol은 구강 편평상피세포암종 세포주에서 세포증식을 억제하였다. 생강추출물은 cleaved PARP 단백질의 발현을 증가시키고, 핵 응축과 DNA 분절을 유도, sub-G1 population 및 Annexin V-stained population을 증가시키는 것을 통해서 세포사멸이 유도되었음을 확인하였다. 또한 생강추출물은 LC3-II 단백질의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라, 이중 막 구조를 가진 자가식포 (autophagosome)의 형성, acidic vesicular organelle 및 LC3 puncta 형성을 증가시킴으로써 자가포식을 유도하였으며, 이는 자가포식 유동 억제가 관련되어 있음을 확인하였다. 구강 편평상피세포암종에서 생강추출물의 자가포식 및 세포사멸에 대한 효능은 소포체 스트레스 관련 단백질인 CHOP의 증가를 통해 초래됨을 확인하였다. Gas chromatography/mass spectrometry를 통해 생강추출물의 주요 생리활성물질인 1-dehydro-6-gingerdione 및 8-shogoal을 분리하였고, 이 주요 생리활성물질이 CHOP의 발현을 증가시킴으로써 자가포식 및 세포사멸을 유도할 수 있는 생강추출물의 항암 효능에 기여하는 유효 성분일 가능성이 있음을 확인하였다.