Regulation of osteoclastogenesis and immune response to staphylococcal infection by cyclic dinucleotides

Abstract

1. 목 적 숙주-세균 상호작용은 세균에 존재하는 미생물-연관 분자패턴이 숙주세포의 패턴인식수용체를 활성화시킴으로써 일어나게 된다. 다양한 미생물-연관 분자패턴 중 고리형 디뉴클레오타이드 (cyclic dinucleotdie, CDN)는 이차전달체로 대부분의 세균이 분비하고 있으며, 세균의 생장, 집락 형성, 바이오필름 형성 등에 필수적으로 관여하는 물질이다. 또한 분비된 CDN은 숙주 면역세포에 존재하는 stimulator of interferon genes (STING)에 의해 인지되고 면역반응을 활성화시켜 숙주-세균 상호작용에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 하지만 기존 연구에서는 CDN 단일의 면역활성 효과만을 검증하였기 때문에 실제 숙주-세균 상호작용의 복합성을 대변하지 못하는 한계가 있다. 따라서 기존연구의 한계를 극복하기 위해 CDN과 다른 요인들의 복합적 효과를 확인하는 연구가 필요하다. 본 연구에서는 CDN이 파골세포분화유도인자 receptor activator of nuclear factor-κB (NF-κB) ligand (RANKL) 또는 세균 세포벽성분과 함께 대표적 선천면역세포인 대식세포의 파골세포 분화 및 면역반응 조절에 미치는 혼합효과를 분자적 수준에서 규명하고자 하였다.

2. 방 법 CDN이 RANKL에 의한 대식세포의 파골세포 분화를 조절하는지 평가하기 위해 골수유래 대식세포를 준비한 후 RANKL과 CDN을 동시처리하여 3일 동안 배양하였다. 파골세포의 분화양상은 TRAP염색법과 RT-PCR기법을 통해 분석하였다. CDN에 의한 영향이 특이적 인식수용체 STING에 의한 것인지 검증하기 위해 대식세포에 STING-siRNA를 처리한 후 CDN과 RANKL을 처리하여 파골세포로 분화를 유도하였으며 TRAP염색법을 통해 분화양상을 확인하였다. 파골세포 분화 중 CDN에 의한 STING 신호활성을 규명하기 위해 STING 하위 신호매개체인 TBK1과 IRF3의 인산화를 Western blotting으로 검증하였다. CDN에 의해 분비되는 인터페론이 파골세포에 영향을 미치는지 확인하기 위해 야생형 및 인터페론수용체결손 C57BL/6 쥐로부터 골수유래 대식세포를 얻고 CDN과 RANKL을 동시처리하여 파골세포로 분화를 유도하였다. 이후 TRAP염색법과 Western blotting을 통해 파골세포 분화양상 및 인터페론수용체 하위 신호매개체의 인산화 정도를 확인하였다. CDN에 의한 파골세포 분화조절 능력의 생체 내 효용성 검증을 위해 CDN과 RANKL을 C57BL/6 쥐의 두개골에 삽입한 후 마이크로 컴퓨터 단층촬영을 이용해 골파괴 정도를 비교분석 하였다. 다음으로 CDN이 감염상황에서 세균에 의한 면역반응에 영향을 미칠지 확인하기 위해 C57BL/6 쥐에 병독성 세균인 Staphylococcus aureus와 CDN을 복강주사 후 쥐의 생존을 시간대별로 확인하였다. 같은 조건에서 혈청을 얻고 CDN에 의한 혈청 내 IL-6 농도를 ELISA를 통해 확인하였다. CDN과 유의적인 혼합효과를 보이는 세균 유래물질을 규명하기 위해 CDN과 야생형 또는 지질단백질결손 S. aureus 사균을 골수유래 대식세포에 동시처리 후 ELISA를 통해 IL-6의 발현양상을 확인하였다. 또한 세균으로부터 지질단백질을 분리하여 CDN과 대식세포에 동시처리하고 ELISA를 통해 IL-6의 발현을 확인하였다. CDN에 의한 면역활성 변화에 핵심적으로 관여하는 인식수용체를 규명하기 위해 대식세포에 STING-siRNA 또는 억제제를 처리하고 CDN과 지질단백질로 자극시킨 후 ELISA로 IL-6의 발현을 비교분석하였다. CDN에 의해 변화하는 염증인자 발현양상에 대한 분자적 기전을 규명하기 위해 대식세포에 CDN과 지질단백질을 혼합처리하고 세포 내 신호전달 매개체 인산화 차이를 Western blotting과 공초점현미경을 통해 관찰하였다. 마지막으로 CDN과 지질단백질 및 IL-6 중성화항체를 쥐의 복강으로 투여하고 생존을 시간대별로 확인하였다.

3. 결 과 CDN은 RANKL에 의한 대식세포의 파골세포 분화를 농도의존적으로 억제하였다. 특히 CDN은 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화 전사인자들을 유의적으로 억제하였다. CDN의 파골세포 분화억제 효능은 파골세포/조골세포 동시배양 환경에서도 확인되었다. 반면 CDN은 조골세포의 분화와 활성에는 아무런 영향을 주지 못하였다. 다음으로 CDN이 RANKL과 함께 대식세포에 처리되었을 때 CDN-특이적 수용체인 STING의 활성화가 나타남을 확인하였다. 또한 CDN의 파골세포 분화 억제효능은 STING-siRNA로 인해 STING의 발현이 감소한 대식세포에서는 관찰되지 않았다. 이로써 STING은 CDN에 의한 파골세포 억제효능에 필수적인 수용체임을 검증할 수 있었다. CDN이 RANKL과 함께 대식세포에 처리되었을 때 파골세포 분화 억제효과를 보이는 인터페론의 발현이 지속적으로 유도되었다. CDN에 의한 억제효과는 인터페론수용체 중화항체로 인하여 감소되었고, 이러한 현상은 인터페론수용체결손 대식세포에서도 확인되었다. CDN은 쥐 두개골에서 RANKL에 의한 파골세포의 분화를 억제하였으며 골 파괴 또한 유의적으로 감소시켰다. 다음으로 CDN을 S. aureus와 함께 복강으로 주사하였을 때, S. aureus 단독주사군에 비해 CDN 동시주사군에서 혈청 내 IL-6 발현의 상승효과가 관찰되었으며 최종 생존율은 감소하였다. 시험관 내 실험에서도 CDN과 S. aureus 사균의 동시처리는 대식세포에서 IL-6 발현에 대한 상승효과를 보였다. 반면 CDN은 지질단백질 결손 S. aureus 사균에 의한 대식세포의 IL-6 발현에 아무런 영향을 미치지 못하였다. CDN에 의한 IL-6의 상승효과는 대식세포에 정제된 지질단백질 또는 합성지질단백질이 동시처리 되었을 때도 관찰되었다. 따라서 CDN은 세균의 지질단백질과 혼합효과를 보이는 것으로 규명되었다. CDN에 의한 IL-6 발현의 상승효과는 STING-siRNA 또는 STING억제제로 STING의 활성이 억제된 대식세포에서 보이지 않았다. 반면 STING의 하위 신호전달 매개체 억제제가 처리된 대식세포에서는 CDN과 지질단백질에 의한 IL-6 발현 상승효과가 유지되었다. 지질단백질은 신호전달 매개체 MAPK 또는 NF-κB의 인산화를 유도하였는데, CDN은 그 중 NF-κB의 인산화와 NF-κB의 핵 내 이동을 증가시켰다. 마지막으로 C57BL/6 쥐의 복강을 통해 지질단백질과 CDN을 주사하였을 때 혈청 내 IL-6가 지질단백질 단독주사군보다 증가하였다. 또한 CDN과 지질단백질의 동시주사로 인한 생존율은 지질단백질 단독주사군과 비교했을 때 감소하였으며, IL-6 중성화항체의 주사로 생존율이 회복됨을 관찰하였다.

4. 결 론 이상의 연구결과를 통해 CDN은 대식세포의 면역활성을 유도하여 파골세포 분화와 골파괴를 억제시키는 긍정적 효과가 있는 반면 세균감염 상황에서는 과도한 면역활성으로 생존율을 감소시키는 부정적 효과도 있음을 확인하였다. 이러한 복합적 결과는 추후 숙주-세균 상호작용을 연구하는데 있어 다중적 요인을 고려하는 것이 필수적이라는 통찰을 제시해 줄 것으로 기대된다.

Introduction

Microbe-associated molecular patterns (MAMPs), which are involved in host-microbe interaction, are recognized by its specific pattern recognition receptors, modulating host immune responses. Among MAMPs, cyclic dinucleotides (CDNs) are second messengers, which are widely expressed in bacteria, acting a critical role in bacterial growth, colonization, and biofilm formation. CDNs are recognized by stimulator of interferon (IFN) genes (STING) present in cytosol to promote host immune responses. However, a little is known about the effects of CDNs on regulation of innate immunity by macrophages during osteoclast differentiation or bacterial infection. In the present study, the roles of CDNs on regulation of osteoclastogenesis and immune responses against staphylococcal infection in macrophages were investigated using in vivo and in vitro models.

Methods

Bone marrow-derived macrophages (BMMs) were stimulated with receptor activator of nuclear factor-κB (NF-κB) ligand (RANKL) in the presence or absence of CDN. Osteoclast differentiation was determined by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining or RT-PCR. BMMs were transfected with STING targeting siRNA or non-targeting siRNA and then transfected BMMs were treated with CDN in the presence of RANKL. The cells were stained for TRAP. BMMs, prepared from wild-type or IFN-α/β receptor (IFNAR1)-/- mice, were treated with CDN in the presence of RANKL. Osteoclastogenesis or activation of IFNAR1 signaling pathway was determined by TRAP staining or Western blotting, respectively. A collagen sheet soaked with CDN in the absence or presence of RANKL was implanted in mouse calvaria. Resorptive area on the calvaria were analyzed by micro-CT scanning. In a separate experiment, mice were administrated with Staphylococcus aureus USA300 with or without CDN via intraperitoneal injection. Survival was monitored daily for 96 hours. In the same condition, serum was collected and cytokine production in serum was determined by Mouse Proteome Profiler Array kit and ELISA. BMMs were stimulated with CDN in the presence of heat-killed S. aureus (HKSa) wild-type or lipoprotein-deficient strain (Δlgt), and IL-6 secretion in the cell culture supernatant was determined by ESLIA. In addition, IL-6 production by BMMs in response to lipoprotein isolated from S. aureus or Pam2CSK4, a synthetic mimicking bacterial lipoprotein, with CDN was determined by ELISA. BMMs, pretreated with STING targeting siRNA or STING inhibitor, were incubated in the combination of CDN and Pam2CSK4 and then IL-6 production was determined by ELISA. Phosphorylation of transcriptional factors was determined by Western blotting or confocal laser microscope analysis. Pam2CSK4 and/or CDN with IL-6 neutralizing antibody were intraperitoneally administered to mice and survival rate was monitored for 96 hours.

Results

CDN inhibited RANKL-induced osteoclastogenesis from BMMs in a dose-dependent manner. In addition, CDN attenuated c-Fos and NFATc1, which are major transcriptional factors, induced by RANKL. CDN also inhibited osteoclast differentiation in osteoclast/osteoblast co-culture systems. Western blotting determined that CDN triggered STING signaling pathway during RANKL-induced osteoclast differentiation from BMMs. Indeed, the inhibitory effect of CDN on osteoclastogenesis was not observed in BMMs transfected with STING targeting siRNA, indicating that STING is essential for the inhibition of osteoclastogenesis by CDN. Moreover, CDNs induced the mRNA expression of IFN-β, which is a negative regulator of osteoclastogenesis. The inhibition of osteoclast differentiation was not observed in the presence of IFNAR1 neutralizing antibody or in macrophages derived from IFNAR1-/- mice. Furthermore, CDN ameliorated RANKL-induced calvarial bone resorption through osteoclastogenesis inhibition. In a separate experiment, when CDN was administered to C57BL/6 mice in combination with S. aureus USA300 by intraperitoneal injection, CDN plus S. aureus USA300 synergistically increased serum pro-inflammatory cytokine levels and mortality compared to S. aureus USA300 alone. Notably, BMMs treated with CDN and HKSa wild-type, but not Δlgt, synergistically increased the IL-6 production in vitro. In addition, CDN together with lipoproteins isolated from S. aureus or Pam2CSK4 promoted the synergistic induction of IL-6. Moreover, CDNs potently activated NF-κB signaling pathway, which is critical for the IL-6 expression, in combination with Pam2CSK4. CDN failed to increase the Pam2CSK4-induced IL-6 production in STING targeting siRNA-transfected or STING inhibitor-pretreated BMMs. On the other hand, TBK1 and IRF3, mediators of canonical STING signaling pathway, were dispensable for the synergistic induction of IL-6 together with Pam2CSK4 since CDN synergistically induced the IL-6 even in the presence of TBK1 or IRF3 inhibitor. Administration of CDN with Pam2CSK4 potently increased the serum IL-6 levels and mortality, while survival rate was restored by IL-6 neutralizing antibody.

Conclusion

The present study demonstrates that CDNs regulate immune activity of macrophages to inhibit osteoclast differentiation and bone destruction induced by RANKL, while exacerbate morbidity and mortality due to excessive IL-6 production in bacterial infection.