Functional production, analyses, and applications of human taste receptors and photoreceptors

Abstract

G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 가장 큰 부류의 막횡단 단백질 패밀리로 시각, 미각, 후각, 신경전달물질 및 호르몬과 같은 대부분의 세포 반응을 매개한다. GPCR의 활동과 기능을 측정하는 것은 식품, 환경 및 생물의학 응용 분야에서 매우 중요하다. 따라서 기능적인 GPCR을 생산하고 공정하는 것은 GPCR 연구 및 실제 응용을 위한 도구를 개발하는 데 중요하다. 인간에게는 시각, 미각, 후각, 청각, 촉각의 다섯 가지 감각이 있다. 오감 중 시각, 미각, 후각은 GPCR 신호전달을 포함한다. A 클래스 GPCR에는 시각과 후각을 담당하는 광수용체와 후각 수용체가 포함된다. 클래스 C GPCR에는 종종 "맛있는" 맛으로 알려진 단맛과 감칠맛에 대한 미각 수용체가 포함된다. 본 연구에서는 다양한 접근 방식을 수행하여 인간의 미각 수용체와 시각 광수용체를 생산하였다. 인간의 단맛 및 감칠맛 수용체를 활용하기 위해 대장균에서 과발현하기 어려운 전체 수용체를 사용하는 대안으로 수용체의 주요 리간드 결합 도메인을 대장균으로부터 대량생산하였다. 생산된 T1R2 VFT와 T1R1 VFT는 실용적인 방식으로 단맛과 감칠맛을 평가하기 위해 트립토판 형광 분석으로 독립적으로 분석되었고 전도성 나노 물질과 결합하여 단맛 및 감칠맛 센서를 제작하였다. 대장균에서 생산한 인간 광수용체 나노디스크와 동물세포에서 생산한 광수용체 발현 바이러스는 여러 분석과 응용을 통해 인간 광수용체의 생리학적 및 생화학적 메커니즘을 더 잘 이해하고 이를 통한 시각 복원 기술 개발에 적용하고자 하였다. 첫째, 인간의 단맛 및 감칠맛 수용체의 주요 리간드 결합 도메인인 T1R2 VFT 및 T1R1 VFT는 전체 수용체를 사용하는 대안 전략으로 대장균에서 기능적으로 생성하였다. VFT의 기능은 각각 대표적인 맛 물질인 수크로스와 MSG를 사용하여 트립토판 형광 분석을 사용하여 테스트하였다. 기능적으로 생산된 VFT는 단맛과 감칠맛 물질을 감지하기 위한 생체 재료로 사용하기 위해 분석 및 검증하였다. 둘째, 인간의 단맛 수용체의 주요 리간드 결합 도메인을 이용하여 실질적인 단맛 물질을 평가하였다. 인간 단맛 수용체의 T1R2 VFT를 사용하여 단맛을 측정하는 비교적 간단한 접근법인 트립토판 형광 분석을 사용하여 단맛 물질에 대한 효능을 평가하였다. 트립토판 분석 결과는 수용체 수준에서 리간드 결합을 해석하는 빠르고 간단한 방법을 제공하기 위해 수크로스에 대한 상대적인 단맛으로 표현되었다. 또한, T1R2 VFT를 CNT-FET의 전극에 고정화하여 단맛을 감지하는 실용적인 단백질 기반 바이오 센서를 제작하였다. 셋째, 인간 감칠맛 수용체의 주요 리간드 결합 도메인을 사용하여 감칠맛 물질과 물질간의 시너지 효과를 트립토판 형광 분석을 통해 평가하였다. 또한, T1R1 VFT는 플로팅 전극 기반 CNT-FET에 고정하였고 전도성 고분자 하이드로겔과 결합하였다. T1R1 VFT를 포함하는 하이드로겔 매개 CNT-FET는 식품에서 감칠맛 화합물을 검출하는 데 유용한 도구일 뿐만 아니라 식품 부문 및 기초 연구에서 중요한 응용을 가질 것으로 예상된다. 마지막으로 광수용체는 대장균과 동물 세포에서 생산하여 다양한 실험과 응용에 사용하였다. 대장균에서 생산된 광수용체 나노디스크는 광학 스위칭과 같은 잠재적인 광학 응용 분야에 사용하기 위한 특성을 측정하는 데 사용하였다. 동물세포에서 생산된 광수용체 발현 바이러스는 눈에서 뇌로 가는 신경 회로의 시험관 내 모델 개발에 사용하였다. 본 연구에서는 인간의 미각 수용체와 시각 광수용체를 생산하고 공정하는 다양한 접근 방식을 적용하였다. 인간의 미각과 시각에 대한 더 나은 이해와 미래의 식품, 환경 및 생물 의학 응용을 위해 인공적으로 생산한 인간 감각 수용체를 사용한 다양한 분석 및 응용도 조사하였다.

G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest transmembrane protein family, mediating the majority of cellular responses such as vision, taste, olfaction, neurotransmitters, and hormones. Measuring the activity and function of GPCR is critical in food, environmental, and biomedical applications. Therefore, producing and engineering functional GPCRs are important in developing tools for GPCR research and practical applications. Humans have five senses: sight, taste, smell, hearing, and touch. Among the five senses, the senses of vision, taste, and smell involve GPCR signaling. Class A GPCRs include photoreceptors and olfactory receptors responsible for vision and smell. Class C GPCRs include taste receptors for sweet and umami taste, often known as palatable taste. In these theses, various approaches to engineer and produce human taste receptors and visual photoreceptors were performed. For utilizing human sweet and umami taste receptors, a primary ligand binding domain of the receptor was mass-produced from E. coli as an alternative strategy to using a whole receptor, which is difficult to overexpress in E. coli. These were analyzed independently with tryptophan fluorescence assay and combined with conducting nanomaterials to evaluate sweet and umami taste in a practical manner. Human photoreceptor NDs produced from E. coli and photoreceptor-expressing virus produced from mammalian cells were analyzed to better understand the physiological and biochemical mechanisms in human photoreceptors and to further apply this knowledge to develop vision restoration technologies. First, a primary ligand-binding domain of a human sweet and umami taste receptor, the T1R2 VFT and T1R1 VFT, were functionally produced from E. coli as an alternative strategy to using a whole receptor. The functions were analyzed by tryptophan fluorescence assay using the representative taste molecule, sucrose, and MSG, respectively. Functionally refolded VFTs have been validated for use as a biomaterial for detecting sweet and umami substances. Second, the ligand-binding domain of the human sweet taste receptor was used to evaluate sweet taste substances in a practical manner. Tryptophan fluorescence analysis, a relatively simple approach for measuring sweet taste using T1R2 VFT of human sweet receptors, was used to assess the efficacy of sweet taste compounds. The tryptophan assay results were expressed as relative sweetness to provide a quick and simple way to interpret ligand binding at the receptor level. Furthermore, a T1R2 VFT was immobilized on the floating electrode of a CNT-FET to develop a protein-based biosensor for the practical detection of sweet compounds. Third, the ligand-binding domain of the human umami taste receptor was used to evaluate umami taste substances and their synergistic effects using tryptophan fluorescence assays. Furthermore, a T1R1 VFT was hybridized with floating electrode-based CNT-FET and combined with a conductive polymer hydrogel. The hydrogel-mediated CNT-FET with T1R1 VFT was anticipated to be a useful tool for detecting umami compounds in foods, as well as a significant application in the food sector and fundamental research. Lastly, the photoreceptors were either produced in E. coli and mammalian cells, and they were used in a variety of experiments and applications. Photoreceptor NDs produced from E. coli were used for measuring the optical properties of their potential optical applications, such as optical switching. Photoreceptor-expressing virus produced from mammalian cells was used for developing in vitro model of a neural circuit for the eye to the brain. In this study, various approaches to engineering and producing human taste receptors and visual photoreceptors were used. Various analyses and applications using engineered human sensory receptors were also investigated for a better understanding of human taste and vision and future food, environmental, and biomedical applications.