Differential roles of two isoforms of Gcr1 transcription factor generated from spliced and un-spliced transcripts in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

As a Crabtree-positive species, regulation of glycolysis in Saccharomyces cerevisiae is important for its adaptation to glucose, the most preferable carbon source. The most important transcription factor for glycolytic gene activation is Gcr1, which was recently revealed to have two isoforms, Gcr1U and Gcr1S. Gcr1S is the major form produced from spliced mRNAs, whereas, Gcr1U is produced from unspliced mRNA, using a translation start codon located in the middle of the intron. In this study, the differential roles of Gcr1U and Gcr1S were identified and applied to lactic acid production.

First, the CRISPR/Cas9-based genome editing strategy was used in order to generate the strains expressing only Gcr1U or Gcr1S isoform. Although these two strains did not show any growth defects and their binding target genes were almost the same, their DNA binding patterns were different. However, by investigating the effects of deleting GCR2, a coactivator of Gcr1, or functional domains of Gcr1 or Gcr2, it was revealed that Gcr1U monomer forms an active complex with its coactivator Gcr2 homodimer, whereas Gcr1S mainly acts as a homodimer without Gcr2.

Second, it was discovered that the USS (un-spliced form specific) domain, 55 residues at the N-terminus existing only in Gcr1U, inhibits the homodimer formation of Gcr1U. This domain even inhibits dimerzation of Gcr1S, acting in trans. The Gcr1S monomer inhibits the metabolic switch from fermentation to respiration by directly binding to the ALD4 promoter, which can be restored by overexpression of the ALD4 gene, encoding a mitochondrial aldehyde dehydrogenase required for ethanol utilization. This respiratory defect also observed when Gcr1S mRNA is overexpressed, indicating that it is important to control the expression level of GCR1S for the respiratory metabolism.

Lastly, the respiratory defect caused by irregular expression of Gcr1S can be beneficial to produce NADH consuming pyruvate derivatives, by mimicking the microaerobic culture condition. The overexpression of GCR1S in the lactic acid producing background strain increased the titer even under aerobic condition. This result shows opposite trend that GCR1WT overexpression under aerobic condition rather decreased the lactic acid production, indicating that the overexpression of proper isoform of Gcr1 can improve the production of traget compound.

크랩트리 양성인 효모 Saccharomyces cerevisiae는 산소의 유무에 관계 없이 포도당을 해당과정과 에탄올 발효를 통해 빠르게 분해하는 대사적 특징을 가진다. Gcr1은 해당과정에 관여하는 유전자들을 조절하는 가장 중요한 전사조절인자로, 최근들어 Gcr1U와 Gcr1S의 두 가지 동위체가 존재함이 밝혀졌다. GCR1 mRNA는 복잡한 스플라이싱 기작을 통해 최소 7개의 서로 다른 스플라이싱 mRNA 결과물을 형성한다. 그러나 그 중 두 개만 정상적인 단백질인 Gcr1A와 Gcr1S로 번역되며 나머지는 모두 제거된다. 스플라이싱 되지 않은 GCR1의 mRNA는 인트론의 중간에 위치한 개시코돈(ATG)을 이용하여 또 다른 단백질 형태인 Gcr1U를 만든다. 본 연구에서는 세 형태의 단백질들 중 가장 주요하게 생성되는 Gcr1U와 Gcr1S의 차등적 역할을 규명하고, 이를 젖산 생산에 활용하였다. 첫째, CRISPR/Cas9을 기반으로 한 유전자 조작 기술을 이용하여 Gcr1U 또는 Gcr1S만 따로 생성하는 균주를 제작하였다. 두 균주는 성장 및 타겟 유전자에서 차이를 거의 보이지 않았으나, 두 단백질의 프로모터에의 결합은 서로 다른 양상을 보였다. 또한, Gcr1의 단백질 도메인 혹은 co-activator GCR2 유전자 결손 연구를 통해 Gcr1U 단백질은 주로 co-activator인 Gcr2 단백질과의 결합하여 타겟 유전자들을 활성화시키는 반면, Gcr1S 단백질은 Gcr2 단백질 없이도 이량체 형성을 통해 활성화된다는 것을 밝혔다. 둘째, Gcr1U의 N 말단에만 존재하는 55개 아미노산으로 이루어진 USS 도메인이 Gcr1U의 이량체 형성을 막는다는 사실을 밝혔다. 이 도메인은 Gcr1S의 이량체 형성 또한 트랜스-액팅 기작을 통해 저해한다. 이로 인해 형성된 Gcr1S의 단량체는 ALD4 (mitochondrial aldehyde dehydrogenase) 유전자의 프로모터에 직접 결합하여 발효에서 호흡으로의 대사 전환을 억제하지만, ALD4 유전자의 과발현시 이러한 결함이 해소되었다. 이러한 표현형은 GCR1S의 mRNA가 과발현되었을 때도 관찰되었으며, 이는 Gcr1S 단백질의 발현양을 적정 수준으로 유지하는 것이 S. cerevisiae의 호흡에 중요함을 시사한다. 마지막으로, Gcr1S의 비정상적 발현 조절로 인한 호흡 대사과정의 결함이 피루브산을 전구체로 하여 NADH를 조효소로 사용하는 물질 생산량 증가에 활용될 수 있음을 밝혔다. 호기성 조건에서 GCR1WT을 과발현 한 경우, 과도한 해당과정의 강화로 인해 젖산 생산이 감소하였다. 반면 GCR1S의 과발현시 호흡과정으로 가는 탄소 흐름의 억제를 통해 젖산 생산을 증가시킬 수 있었다. 본 연구는 적절한 Gcr1 동형체의 발현 조절을 통해 포도당 대사에 있어 발효와 호흡 경로의 분배를 조절함으로써 대사 물질 생산에 활용할 수 있음을 시사한다.