Development of a Novel O-serotyping Method for the Rapid Detection of Various Escherichia coli O-serotypes Using Multiplex Real-Time PCR

Abstract

Foodborne outbreaks caused by pathogenic E. coli are worldwide occurrence that cause illness, economic losses, and even fatalities. Previous studies have shown that E. coli pathogenicity and serotypes are highly correlated; thus, the rapid and accurate identification of E. coli serotypes is essential for preventing severe foodborne outbreaks. In this study, a novel multiplex real-time PCR method was developed for E. coli O-serotyping that overcame some limitations of conventional and in silico serotyping, i.e., it performed with high sensitivity, high specificity, and a low detection limit and reduced O-serotype detection and identification time without any loss of sensitivity and specificity. Specifically, two O-serotype-specific genes, wzy and wzx, were used to design 21 primer/probe sets for determining 21 different O-serotypes. The method was then evaluated using 11 O-serotype reference strains and 43 environmental isolates: O-serotyping was completed in <40 min with a low detection limit of 1–10 pg DNA. In addition, the PCR serotyping method showed the same results as the existing serotyping method, confirming that the method was effective. Importantly, a food application test was also completed: the method could identify O-serotypes in ground beef samples even at 10^1 CFU per sample. Based on our results, our novel method can be considered the optimal O-serotyping tool for the determination of E. coli O-serotypes produced to date. The developed multiplex real-time PCR serotyping method can rapidly, inexpensively, and accurately identify E. coli O-serotypes; therefore, it could help prevent foodborne outbreaks.

병원성 대장균에 의해 발생하는 식품 매개 감염병은 전 세계적으로 일어나고 있으며, 경제적 손실과 관련 질병을 유발하고, 심지어 사망을 야기하기도 한다. 이전의 연구들은 대장균의 병원성과 혈청형이 높은 상관관계가 있다는 것을 보여주었기 때문에, 대장균 혈청형의 신속하고 정확한 식별은 심각한 식품 매개 감염병 발병을 예방하는 데 필수적이다. 본 연구에서는 real-time PCR을 이용한 새로운 O-혈청형 동정 방법을 개발하여, 기존의 O-혈청형 동정 방법인 antiserum방법과 in silico 동정 방법의 한계를 극복하였다. 즉, 높은 감도와 특이성을 가지며 낮은 검출 한계를 극복하고 감도의 손실 없이 O-혈청형 검출 및 동정 시간을 단축하였다. 구체적으로, 두 개의 O-혈청형 특이 유전자인 wzy와 wzx가 서로 다른 O-혈청형을 결정하기 위한 21개의 프라이머/프로브 세트를 설계하는데 사용되었다. 그런 다음 11주의 reference대장균과 43주의 환경 분리 대장균을 사용해 방법을 평가하였다. O-혈청형 동정 방법은 1–10 pg DNA의 낮은 검출 한계를 가지며 40분 안으로 완료되었다. 또한 PCR 혈청형 동정 방법은 기존 혈청형 동정 방법과 동일한 결과를 보여 효과적임을 확인할 수 있었다. 식품 적용 테스트 또한 완료되었다. 이 방법은 다진 소고기 샘플에서 O-혈청형을 샘플 당 10^1 CFU에서도 식별할 수 있었다. 본 연구의 결과에 따르면, 새로운 이 방법은 현재까지 대장균 O-혈청형을 동정하기 위한 최적의 방법으로 간주될 수 있다. 개발된 real-time PCR 혈청형 동정 방법은 빠르고, 저렴하고, 정확하게 대장균 O-혈청형을 식별할 수 있으므로, 식중독 발생을 예방하는 데 도움이 될 수 있다.