Isolation and Characterization of Novel Bacteriophages KPP2018 and KPP2020 infecting Klebsiella pneumoniae and Development of a Phage Cocktail as a Biocontrol Agent in Food

Abstract

Klebsiella pneumoniae is a well-known opportunistic human pathogen causing chronic pulmonary obstruction and primarily infects the immunocompromised individuals in nosocomial environment. This pathogen can produce extended-spectrum beta-lactamases (ESBL), which are resistant to almost all beta-lactam antibiotics, and nowadays carbapenem-resistant strains are increasing. Recently, Klebsiella pneumoniae is detected in food samples, especially in poultry products or in raw vegetables. Therefore, the development of new agent is urgently needed and to control this pathogen, 12 Klebsiella-infecting phages were isolated from sewage samples. The analysis of host range revealed that the isolated phage KPP2020 has high host specificity among them, inhibiting only K. pneumoniae. The phage KPP2018 infects K. pneumoniae mainly, also infects Shigella spp., and Salmonella serovars. Morphological observation using TEM showed that both phages belong to the family Siphoviridae. The stability of KPP2020 and KPP2018 was maintained for 12 h under stress conditions (-20~60℃ and pH 3~11 for KPP2020 and -20~65℃ and pH 3~12 for KPP2018). Bacterial challenge assay of KPP2020 showed 3.51 log reduction of K. pneumoniae KCTC 2242 within 2 h. The complete genomes of KPP2020 and KPP2018 were analyzed and revealed that KPP2020 consists of 49,044 bp containing 95 ORFs with a GC content 51.33%, while KPP2018 consists of 137,988 bp DNA with 228 ORFs. Subsequent bioinformatics analysis revealed no toxin genes or virulence factor, suggesting the safety for human applications. Comparative genome analysis about tail gene cluster was conducted and there was no identity between KPP2020 and KPP2018 tail-related genes, indicating that differences in host range results may related to this. Application of KPP2020 using cutting board showed about 4 log reduction for at least 7 h, indicating that KPP2020 has potential to control K. pneumoniae effectively. Food application of the phage cocktail consisting of KPP2020 and KPP2018 in a 1:1 ratio using chicken meat showed higher lytic activity (4.35 log reduction within 2 h) and phage resistance of indicator strain developed slower than that of single phages. KPP2020 can lower the secretion of pro-inflammatory cytokines of K. pneumoniae infected RAW 264.7 cells, suggesting that KPP2020 has therapeutic effect against bacterial infection. KPP2020 does not induced inflammatory response of RAW 264.7 cells and not involved in the response induced by LPS, suggesting that KPP2020 can be an effective therapeutic agent against bacterial infection. Therefore, these two novel bacteriophages KPP2020 and KPP2018 can be used as natural food preservatives for food safety, and KPP2020 can be a therapeutic agent against K. pneumoniae infection.

클렙시엘라 뉴모니애는 만성 폐 장애를 일으키는 균주로, 선택적으로 병원성을 가지는데 주로 병원 환경에서 면역이 약화된 개인을 감염한다. 이 병원균은 대부분의 베타-락탐 항생제에 내성이 있는 ESBL을 생성할 수 있고, 최근에는 식품, 특히 가금류나 야채에서 클렙시엘라 뉴모니애가 검출되는 사례가 증가하고 있어서 이를 제어하기 위한 새로운 제제의 개발이 시급하다. 이를 제어하기 위해서 클렙시엘라를 감염하는 파지를 하수 처리장에서 분리했다. 각 파지의 감염 범위를 분석한 결과, KPP2020은 클렙시엘라 뉴모니애만을 억제하는 아주 높은 숙주 특이성을 보이는 것을 확인했고, KPP2018은 주로 클렙시엘라 뉴모니애를 감염하며, 시겔라 속, 살모넬라도 감염하는 것을 확인하였다. 투과 전자 현미경을 사용한 형태학적 관찰을 통해, 두 파지 모두 Siphoviridae 과에 속한다는 것을 알 수 있었다. 다양한 스트레스 조건에서 KPP2020과 KPP2018의 안정성을 확인해본 결과, KPP2020의 경우, -20℃에서 60℃ 그리고 pH 3에서 11까지, KPP2018의 경우, -20℃에서 65℃ 그리고 pH 3에서 12까지 범위 안에서 12시간 동안 안정적이었다. KPP2020의 숙주 제어 능력을 확인한 결과, 클렙시엘라 뉴모니애를 2시간 이내에 3.51 로그 감소시키는 것을 확인하였다. KPP2020 및 KPP2018의 유전체를 분석하였고, 파지 꼬리 부분에 해당하는 유전자군을 비교 분석한 결과, KPP2020과 KPP2018 사이에는 상동성이 없었으며, 이는 두 파지의 감염 범위의 차이와 연관이 있음을 확인하였다. 클렙시엘라 뉴모니애가 오염된 도마에 KPP2020을 적용하여 균주 저해 효과를 확인한 결과, 최소 7시간 동안 지속적으로 4 로그 이상의 균을 감소시키는 것을 확인하였다. 식품에서 파지를 더 효과적으로 적용하기 위해 KPP2020과 KPP2018을 1:1 비율로 혼합하여 파지 칵테일을 제작하였고, 이를 닭고기에 적용해 보았을 때, 단일 파지보다 더 높은 용균 활성을 보였고 (2시간 내 4.35 로그 감소), 파지에 대한 균주의 저항성이 더 느리게 생성되었다. KPP2020은 클렙시엘라 뉴모니애가 감염된 RAW 264.7 세포에서 전 염증성 사이토카인의 분비를 낮출 수 있어 KPP2020이 세균 감염에 대한 치료 효과가 있음을 시사한다. KPP2020을 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때 전 염증성 사이토카인이 발현되지 않았고, LPS로 인해 염증 반응이 활성화된 RAW 264.7 세포에 파지를 처리하였을 때 사이토카인의 발현에 관여하지 않기 때문에 KPP2020은 더 효과적인 치료제로서 사용될 수 있다. 본 연구를 통해 새로운 박테리오파지 KPP2018과 KPP2020은 식품 안전을 위한 천연 식품 첨가제로 사용될 수 있으며, KPP2020은 세균 감염에 대한 치료제가 될 수 있음을 확인하였다.